Как изменить днк вируса

Любая прививка должна выполнять задачу формирования иммунитета для борьбы с опасной инфекцией. Однако если раньше вакцины состояли из мертвых или ослабленных микроорганизмов, то самые новые противовирусные вакцины – это сложные продукты генной инженерии.

Генетика – это наука, которая у многих людей вызывает опасения и недоверие. Сегодня мы расскажем, как на самом деле работают новейшие генные вакцины, о которых так много говорят, и могут ли они изменить ДНК человека. А также мы познакомим Вас с существом, которое действительно меняет наш генетический код.

Как в массовом сознании возникла идея возможности изменения ДНК человека путем инъекции? Все началось с фильмов о зомби-апокалипсисе и комиксов о супергероях.

История человека-паука с точки зрения науки

Многие смотрели фильм про человека-паука, который начинается с того, что студента кусает генно-модифицированный паук. После этого гены паука встроились в ДНК человека, и обычный парень получил сверхспособности – научился лазать по стенам и выпускать паутину.

Однако ученые-генетики обращают внимание на то, что сюжет фильма – это чистая фантазия. В реальности такое произойти не может. Просто потому, что яд паука состоит из глобулярных белков, и в нем вообще нет паучьей ДНК.

Зато в новейших вакцинах есть молекулы генетического кода вируса. Давайте рассмотрим две самые передовые вакцины, о которых сегодня можно услышать из каждого утюга.

Векторная вакцина

Огромное преимущество этой вакцины в том, что человеку вводят не сам опасный вирус, как это делалось раньше, а лишь маленький кусочек его генетического кода. Таким образом, вероятность заражения и тяжелых побочных эффектов практически отсутствует.

Генетический код опасного вируса буквально режут на части, извлекая из него маленький фрагмент. Этот фрагмент отвечает за производство поверхностных белков вирусной частицы, которые еще называют «шипами». Вирус использует эти «шипы» как консервный нож для вскрытия человеческой клетки и проникновения внутрь.

Но сам по себе этот фрагмент вирусного гена не может попасть в клетку. Поэтому его доставляют с помощью вектора.

Вектор – это другой вирус, который выполняет роль доставщика. И лучше всего с этой ролью справляется обыкновенный аденовирус, который вызывает простуду.

В процессе изготовления вакцины ДНК аденовируса подвергается двум изменениям:

• Аденовирус лишают функции размножения, что делает его безопасным для человека.
• В ДНК аденовируса встраивают тот самый ген опасного вируса, от которого необходимо привиться.

После введения вакцины аденовирус проникает в клетки человека, высвобождая внутри клеточного ядра свою ДНК. Эта ДНК не может копировать сама себя и вызвать инфекцию. Вместо этого она превращает клетку в нано-фабрику по производству шипов опасного вируса.

Важно!

Шипы вируса в отсутствие самой вирусной частицы совершенно безвредны для человека.

Произведенные вирусные шипы выступают на поверхности клетки, а наш иммунитет, распознав в них чужеродный элемент, немедленно блокирует зараженную клетку и вырабатывает антитела к незнакомому белку.

Может ли аденовирусный вектор повредить ДНК человека?

По сути, аденовирусный вектор мало чем отличается от обычного аденовируса, которым в течение жизни заражаются практически все люди на Земле. А манипуляции с ДНК принципиально не меняют его поведение.

По словам Линды Кофлан, исследователя векторных вакцин из Университета Мэрилэнда, аденовирус не имеет ферментативного механизма для присоединения к человеческой ДНК. Дело в том, что две молекулы ДНК не могут объединиться сами по себе, без специального фермента. Аденовирус не обладает таким ферментом и полностью безопасен для генома человека. Именно этим обстоятельством руководствовались разработчики вакцины, выбрав аденовирус в качестве «доставщика».

А учитывая, что вектор лишен способности размножаться, в момент гибели зараженной клетки ДНК вектора поглощается и расщепляется нашими иммунными клетками. Вакцина исчезает без следа, а человек приобретает иммунитет к опасному вирусу, с которым может столкнуться в будущем.

Грегори Поланд, доктор медицинских наук из клиники Мэйо, обратил внимание на то, что изготовители вакцин всегда используют специальные культуры аденовирусов, которые классифицируются как неинтегрирующиеся. Это значит, что безопасность данных векторов для ДНК человека и животных была доказана многократными исследованиями.

Интересный факт!

По мнению ученых, именно векторные вакцины в будущем могут навсегда избавить человечество от рака и ВИЧ-инфекции.

РНК-вакцина

Чтобы понять, как она работает, необходимо знать, что такое матричная РНК.

Главным компонентом таких вакцин служит матричная РНК. Эта информационная молекула является копией небольшого участка ДНК. Каждая наша клетка непрерывно создает большое количество таких информационных молекул. По сути, матричная РНК – это крошечная фабрика по сборке определенного белка, необходимого клетке. Каждый вид матричной РНК способен собирать только один вид белка.

Но когда вирус проникает в человеческую клетку, его геном производит свои собственные, вирусные фабрики, которые используют ресурсы клетки для сборки новых вирусов. Именно матричная РНК собирает те самые шипы вируса, которыми он вскрывает клеточную стенку.

Как действует РНК-вакцина?

Цель генетиков – внедрить в наши клетки матричную РНК, создающую вирусные шипы. Причем ученые создают эту молекулу искусственно, буквально собирают по крупицам, окружая каждую РНК специальной липидной оболочкой.

Благодаря липидной оболочке матричная РНК попадает в наши клетки и начинает активно производить вирусные шипы.

Далее события развиваются так же, как в случае с векторной вакциной – вирусные шипы выступают на поверхности клетки, и на них реагирует наша иммунная система.

Преимущества такого метода вакцинации огромны:

• Во-первых, матричная РНК содержит только инструкции по сборке вирусных шипов и не может воссоздать вирус целиком.
• Во-вторых, в отличие от векторных вакцин, РНК-вакцины не содержат никаких живых организмов, наподобие аденовируса.

Однако есть и недостатки:

• Существует мнение, что РНК-вакцины могут вызывать осложнения, в частности, аутоиммунные заболевания и образование тромбов.

Могут ли РНК-вакцины изменить ДНК человека?

1. Матричные РНК – это естественные информационные молекулы, способные только собирать белки. Каждая такая молекула существуют всего 72 часа, после чего она распадается на части.

2. ДНК – это длинная двуцепочечная молекула, а матричная РНК состоит из одной короткой цепочки. По своей структуре матричная РНК сильно отличается от ДНК и даже теоретически не может соединиться с этой более сложной молекулой.

3. ДНК человека защищена ядром клетки. А матричная РНК работает в цитоплазме и никогда не попадает в ядро.

Завершая разговор о вакцинах, хотим отметить, что единственная возможность для изменения человеческой ДНК – это использование в составе вакцин фермента интегразы, способного объединить две молекулы ДНК в одну. Но производители не используют этот фермент при изготовлении вакцин. Зато этим ферментом обладает существо, которое живет с нами рядом уже миллионы лет.

Что вирус может сделать с нашей ДНК?

Итак, вирус действительно способен изменить ДНК человеческой клетки. Но далеко не каждый! Такой способностью обладают только ретровирусы.

Это семейство вирусов обладает особым ферментом – «интегразой». Этот фермент буквально приклеивает вирусный геном к ДНК человека, подчиняя себе клетку и заставляя ее создавать новые ретровирусы.

В большинстве случаев зараженная клетка с испорченным ДНК погибает. Однако в редких случаях ретровирус заражает сперматозоид или яйцеклетку. И если происходит оплодотворение с участием зараженной клетки, то абсолютно все клетки эмбриона будут содержать вирусную ДНК. Фактически, этот вирус способен создавать мутантов.

К счастью, это происходит крайне редко. Последний раз ретровирус изменил геном человека более 100 тысяч лет назад. Однако за время эволюции это происходило много раз, поэтому ДНК человека на целых 8% состоит из кусочков ДНК древних ретровирусов, которые заражали половые клетки наших предков.

Ученые утверждают, что ретровирусы являются мощным двигателем эволюции. Например, именно благодаря встрече с ретровирусом у предка всех млекопитающих, жившего 160 миллионов лет назад, появился такой важный орган как плацента.

Интересный факт!

Ретровирус может быть как относительно безопасным, так и смертельным. Самым опасным ретровирусом для человека является ВИЧ.

Почему люди относятся с подозрением к новым вакцинам?

Вакцины, созданные методами генной инженерии, совсем недавно вошли в нашу жизнь, но пока не известен ни один случай генных мутаций, связанных с вакцинацией. Однако люди склонны опасаться нового и неизвестного и поэтому часто верят в нелепые теории заговора о массовом чипировании или планах мирового правительства по снижению населения Земли. Как правило, лица, распространяющие подобные теории, имеют весьма приблизительное представление о том, как работают современные вакцины. Покажите им эту статью – возможно, этим Вы кому-то спасете жизнь.

Статья на конкурс «Био/Мол/Текст»: Вирусы умеют не только размножаться внутри клеток хозяина, но и прятаться от его иммунитета. Способов избежать фатальных встреч с оборонными силами организма существует множество, но один из самых хитрых (и потому особенно интересных) механизмов демонстрируют вирусы с измененными генетическими последовательностями. Эта статья расскажет, что такое генотипы и генетические варианты вирусов и почему так важно о них знать.

Зачем нам знать о генетических вариантах вирусов?

Новости о коронавирусе на протяжении всего 2020 года оставались самыми читаемыми, а количество научных публикаций о SARS-CoV-2 почти в пять раз превысило число статей по другой «громкой» теме — системам CRISPR/Cas: по данным PubMed их уже больше 60 тысяч! И здесь важнее следить не столько за драматической статистикой заражений и исходов, сколько за потенциалом и способностями возбудителя. Ведь вирусы умеют мутировать и порождать таким образом новые генетические варианты [1].

Генетические варианты вируса — это геномы какого-то вида (или штамма) вируса, отличающиеся друг от друга по последовательности нуклеотидов, и эти отличия могут обусловливать появление новых штаммов. «Генотип», «субтип», «генетический вариант» — термины, отражающие степень геномных различий (в порядке убывания).

По мере накопления знаний по этой теме опасения ученых лишь крепли: мутации могут влиять как на вирулентность, так и на тяжесть протекания заболевания, развитие лекарственной устойчивости и вероятность повторного заражения [2].

У SARS-CoV-2 весной 2020 года выделяли 3 генотипа: A, B и C [1]. Но сейчас особое внимание обращают на некоторые генетические варианты этого вируса и их географическое распределение (рис. 1) [3]. Известно, что даже самое маленькое изменение в генетическом материале возбудителя способно сильно сказаться на протекании либо распространении заболевания. На что же могли повлиять мутации в геноме SARS-CoV-2?

Например, единственная мутация в гене поверхностного белка (spike-белка), вызвавшая замену его 614-й аминокислоты — D614G, — способствовала распространению SARS-CoV-2 по миру [4], [5].

Другая мутация, C14408T, в последовательности, кодирующей вирусную РНК-зависимую РНК-полимеразу (RdRp), потенциально способна влиять на развитие лекарственной устойчивости [6], [7]. Но самым поразительным можно считать случай, когда у пациента один генетический вариант SARS-CoV-2 заместился другим [8]. Дело в том, что наша иммунная система выстраивает защиту, по сути, от определенного вирусного генотипа. Если же вирус меняется, организм, встречавшийся с его предшествующим вариантом, новый может и не узнать.

Однако можно чуть-чуть успокоиться: мутации SARS-CoV-2 хоть и устроили хорошую суматоху, но так и не показали пока явной клинической значимости — в отличие от изменений ряда других вирусов. О них и пойдет речь дальше.

Вирусы гепатитов и компания

Гепатиты

В 2020 году Нобелевскую премию по физиологии или медицине вручили за открытие возбудителя одного из гепатитов — вируса гепатита С (ВГС, HCV) [9]. Болезнь может протекать без видимых симптомов, но при этом вирус сильно поражает печень. В крайних случаях развивается цирроз или даже рак печени [10]. К счастью, уже есть эффективные средства от гепатита С: по словам нобелевского лауреата Харви Олтера, противовирусные препараты прямого действия позволяют излечивать 95–98% пациентов [9]. Так в чем же подвох?

У вируса гепатита С выделяют семь генотипов (табл. 1) [10], и чтобы выбрать оптимальный курс лечения, необходимо сначала определить генотип возбудителя, инфицировавшего конкретного пациента . Несмотря на то, что уже появились пангенотипные (универсальные, не зависящие от генетического варианта вируса) схемы терапии, они труднее доходят до пациентов, в том числе из-за их стоимости [11].

Интересно, что ВГС генотипов 1 и 4 обычно хуже поддаются терапии и требуют более продолжительного лечения, чем 2 и 3 [12].

При этом из-за высокой генетической вариативности, то есть больших различий между вирусными генотипами (до 30–35%), против ВГС не получается создать эффективную вакцину. Проблема усугубляется тем, что для тестирования прототипов вакцин нужны небольшие модельные животные, а получить мышей, способных одновременно болеть гепатитом С и имитировать человеческий иммунный ответ на инфекцию, очень трудно. И наконец, для изучения вируса in vitro нужно нарабатывать заразные частицы ВГС, а способные на это клеточные культуры появились лишь недавно [14].

Секвенирование вирусного генома показало, что в России циркулирует рекомбинантный вариант ВГС (RF2k/1b), генетически сходный с генотипами 1 и 2 одновременно. Из-за такой маскировки детекция этого генотипа затруднительна, а значит, и лечение бывает менее эффективным [15].

Итак, чтобы эффективно справиться с гепатитом С, нужно определить генотип его возбудителя. Не менее важно знать и генотип вируса, вызывающего другой гепатит — гепатит B. Да, от ВГВ (HBV) существует прививка [16]. Но! Есть основания считать, что генотипы ВГВ, несмотря на относительно небольшую вариативность (около 8% генома), по-разному влияют на тяжесть заболевания [17], [18].

Стоит, однако, учитывать, что результаты исследований связи вирусных генотипов с особенностями течения болезни весьма противоречивы. Чаще всего это связано с недостаточным размером изученных выборок, что, в свою очередь, обусловлено сложностями массового генотипирования. Из-за этого, например, на Тайване развитие гепатоцеллюлярной карциномы связывают с ВГВ генотипа В, а в Японии и КНР — с ВГВ генотипа С [19]. Тем не менее некоторые авторы приходят к выводу, что генотип ВГВ вообще не имеет большого клинического значения [20].

Хоть пока и нет общих рекомендаций проводить генотипирование ВГВ, ряд ученых призывает сделать его обязательным, поскольку пангенотипной терапии в случае гепатита В не разработано, а эффективность лекарств порой разнится в зависимости от генотипа.

Детекция генотипа вируса может стать хорошим подспорьем для врачей как минимум в двух направлениях: в определении вероятности развития той или иной формы болезни у конкретного пациента и в персонализации лечения. Однако подобных исследований крайне мало, можно даже сказать, что это поле еще совсем не пахано.

Денге

Мы уже заметили, что при разработке вакцин необходимо знать и учитывать разнообразие генотипов вируса. В этом отношении яркими примерами могут служить подходы к производству вакцин от гриппа и менее распространенной болезни — лихорадки денге, о возбудителе которой мы сейчас и расскажем [21].

У вируса денге выделяют четыре серотипа, то есть четыре группы вирусов с общей антигенной структурой. Генотипов у этого возбудителя больше, соответственно, и отслеживать их сложнее. Увы, но знания серотипа порой недостаточно для качественной вакцинации. Например, низкую эффективность одной из проходивших клинические исследования вакцин против серотипа 2 можно объяснить большой вариативностью составляющих его генотипов [22].

Существует мнение, что если эффективность вакцин против денге в новых клинических исследованиях останется низкой, при создании вакцинных препаратов необходимо будет отталкиваться именно от результатов генотипирования [21]. Это нужно и для исключения возможного антителозависимого усиления инфекции в случае, если вакцина будет защищать не от всех серотипов/генотипов, с которыми может встретиться отдельный организм.

Подводя итог, можно сказать, что знание генотипов вирусов необходимо для отслеживания распространения заболеваний по миру, для их лечения, а также для получения эффективных вакцин. К сожалению, пока генотип-специфичная борьба с инфекциями сильно ограничивается в том числе и недостатком информации о вирусных штаммах.

Но как вообще появляется это штаммовое разнообразие?

Вирусная хитрость: механизмы изменения геномов

Вирусы способны изменять свои свойства внутри клеток хозяев и в результате становиться заразнее и опаснее. Впрочем, не стоит пугаться. Обычно вирусная эволюция протекает в сторону снижения летальности, поскольку вирусу, который не убивает своего носителя и почти не вызывает симптомов, намного проще распространиться в популяции. Хоть геномы вирусов и изменяются с довольно высокой частотой, на деле мутации чаще оказываются нейтральными, не влекущими заметных последствий для вируса и его хозяина. Очень немногие из них действительно вносят вклад в дальнейшую эволюцию [24].

В основе способности вирусов к изменениям лежат мутации и/или обмен генетическим материалом между разными вирусами, результаты которых закрепляются или не закрепляются давлением естественного отбора.

Мутация — это изменение последовательности нуклеотидов в определенном участке генома, нередко приводящее к изменениям структуры и/или функций организма или вируса. Мутации могут возникать из-за ошибок работы ферментов, создающих копии геномов, или под действием среды.

Когда одну и ту же клетку заражает два родственных вируса, могут образовываться гибридные вирусы, содержащие измененный по сравнению с родительскими формами генетический материал. Этот процесс называют рекомбинацией или реассортацией, если у вирусов сегментированный геном (в частицу он упаковывается отдельными сегментами типа мини-хромосом) [25].

Реассортация очень напоминает появление детей у родителей: когда два разных вириона попадают в одну клетку и приступают к размножению, они могут обменяться частями геномов (рис. 3). В результате получится новая вариация (штамм) вируса, которая может значительно отличаться от своих предков [25]. Такие вирусы порой становятся неузнаваемыми для иммунной системы и распространяются, вызывая эпидемии и пандемии. Этот сценарий характерен, например, для вирусов гриппа. Некоторые исследователи винят в пандемии той же «испанки» именно вирусную реассортацию [26].

Благодаря мутациям и обмену генетическим материалом вирус может даже менять своего хозяина. Так SARS-CoV-1 от летучих мышей перешел в семейство виверровых (к мусангам и циветам), а затем и к людям. В начале 2000-х этот вирус вызвал эпидемию, охватившую 29 стран [28].

Новые генотипы могут возникать и в ходе лабораторных пассажей, когда вирусом последовательно заражают нескольких животных, выделяя из них новую чистую культуру возбудителя [29]. Такая процедура нужна, в частности, для тестирования противовирусных лекарств и вакцин.

Свойства вируса во время пассажей меняются ступенчато. В первых пассажах в основном обнаруживают вирионы, изменившие какой-то один генетический признак. Но с увеличением числа пассажей у подавляющего большинства вирусных частиц наблюдают изменение многих генетических признаков.

Кроме рекомбинации и мутаций, изменчивость вируса может быть обусловлена влиянием хозяина (host-controlled variation). Такие модификации не затрагивают генетический материал вируса и встречаются, например, у ДНК-содержащих бактериофагов, вирусов гриппа и Сендай. Клетка может влиять на характер синтезируемых в ней вирусных компонентов. Или в вирусную частицу могут попадать хозяйские белки и липиды. Поэтому при смене клетки-хозяина в структуре оболочки вириона меняются и антигены, с помощью которых организм узнает вирус.

Итак, образование новых вирусных генотипов — совершенно обычное явление, основанное на стандартных эволюционных процессах. Однако как нам эти генотипы детектировать?

Как выявляют генотипы вирусов?

Теперь, когда мы знаем, как возникают вирусные генотипы и как от генетического варианта возбудителя могут зависеть течение, распространение и лечение заболевания, перейдем к обсуждению лабораторных методов. Они позволяют нам определять, вирус какого генотипа вызвал болезнь у конкретного пациента. Рассмотрим методы детекции генотипов на примере вируса ВГС. В настоящее время лабораторные анализы, используемые в схемах диагностики и лечения гепатита C, представлены серологическими тестами для обнаружения антител к ВГС, молекулярными тестами для выявления и количественной оценки РНК ВГС, а также методами генотипирования возбудителя [30].

При первоначальной диагностике гепатита C учитывают симптоматику и уровни ферментов печени (особенно аланинаминотрансферазы, АЛТ) в крови. У пациентов с подозрением на гепатит C иммуноферментным анализом (EIA) [31] или хемилюминесцентным иммуноанализом (CIA) выявляют антитела к ВГС. В популяциях с низким риском инфицирования этим вирусом отрицательного результата EIA или CIA достаточно, чтобы исключить заражение гепатитом C. Но важно помнить, что у пациентов с ВИЧ или последней стадией почечной недостаточности серологические тесты на антитела к ВГС могут давать ложноотрицательные результаты. Если тест выявил антитела или допускается возможность ложноотрицательного результата, в организме пациента должны искать РНК самогό вируса.

Определение статуса инфекции ВГС, решение о лечении и мониторинг ответа на него зависят от трех важных факторов: обнаружения РНК вируса гепатита С, ее количества и вирусного генотипа. Для оценки всех этих параметров есть несколько коммерческих тест-систем. Они различаются по диапазону обнаружения, чувствительности, специфичности, стоимости и сложности использования.

Выявление РНК вируса гепатита С основано на принципе амплификации нуклеиновых кислот [32], причем применяют здесь комбинацию разновидностей полимеразной цепной реакции (ПЦР): качественную ПЦР, опосредованную транскрипцией амплификацию (ТМА) и количественную ПЦР в реальном времени.

Генотипирование ВГС необходимо для назначения оптимальной схемы лечения. Генотип этого вируса можно определить несколькими методами, нацеленными на гены вирусных белков (E1, NS4 и NS5) и на 5′-нетранслируемую область (5′-UTR) генома ВГС. Они включают простую ПЦР, гибридизацию с генотип-специфичными зондами и ПЦР в реальном времени. Однако для более точного определения вирусного генотипа следует прибегать к методам секвенирования нового поколения (NGS) [33].

Наш проект HaploSense

Как мы уже поняли, определять генотипы сложно, поскольку практически нет быстрых и доступных тестов. Наша команда студентов и аспирантов под названием Moscow 2020 решила изменить эту ситуацию.

На международном конкурсе iGEM в этом году мы представили проект детектора генотипов вируса гепатита С. В основе детекции лежит система CRISPR-Cas, с которой многие читатели уже знакомы [34], [35], а принцип работы напоминает популярные методы детекции SHERLOCK (Specific High sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing) и DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter) [35]. Но есть и важные отличия, о которых сейчас расскажем.

В своей тест-системе мы использовали самый маленький из открытых к этому моменту Cas-белков — CasX (или Cas12e) из Deltaproteobacteria: он состоит из 980 аминокислотных остатков по сравнению с 1300 у Cas9 [36]. Как и Cas13a с Cas12a, маленький CasX обладает коллатеральной нуклеазной активностью (может неспецифически резать нуклеотидные последовательности, с которыми встретится после связывания с мишенью): она позволяет разрезать олигонуклеотиды с флуоресцентными метками после прикрепления белка к геному вируса. Но ВГС — РНК-содержащий вирус, поэтому для связывания с ним CasX нужно провести дополнительную реакцию: с помощью обратной транскрипции получить комплементарную последовательность ДНК.

Итак, в нашей системе четыре основные стадии (рис. 4):

1. HUDSON. Проба нагревается до 95 °С, при этом нейтрализуются и вирус, и РНКазы [37].
2. RT-LAMP. Проводятся обратная транскрипция и изотермическая амплификация генетического материала вируса — уже в виде ДНК [38]. Благодаря использованию LAMP (loop-mediated isothermal amplification) для тестирования не нужны дорогие ПЦР-приборы, понадобится лишь простой термостат для поддержания постоянной температуры.
3. Детекция. CasX связывается с ДНК-мишенью и за счет коллатеральной активности разрезает короткие одноцепочечные ДНК, меченные флуорофором FAM и биотином на противоположных концах.
4. Визуализация. Полученная смесь наносится на тест-полоски с двумя зонами связывания: одна — контрольная, содержащая стрептавидин и взаимодействующая с любыми олигонуклеотидами, меченными биотином (и разрезанными, и целыми), вторая — зона связывания разрезанных олигонуклеотидов без биотина, но с FAM. Таким образом, при помещении полоски во флуориметр две линии будут означать, что пациент инфицирован ВГС определенного генотипа.

Пока наша тест-система предполагает определение только одного генетического варианта ВГС — рекомбинантного RF2k/1b, распространенного в России. В 2020 году доступ в лабораторию для нас был закрыт, поэтому систему предстоит еще собрать и протестировать. Если все лабораторные испытания пройдут успешно, мы планируем расширить специфичность системы на все генотипы вируса, не умножая при этом количество приборов.

Такая на первый взгляд сложная система позволит определять генотип возбудителя гепатита С быстрее, вне специально оборудованной лаборатории и с не меньшей точностью, чем ПЦР. Мы надеемся, что когда-нибудь такой подход поможет сделать тестирование массовым и доступным.

Подробнее о iGEM

В 2020 году команда студентов с биологического факультета МГУ представила свою разработку на самом престижном международном конкурсе по синтетической биологии — The International Genetically Engineered Machines competition (iGEM). С английского название переводится как «Международное соревнование генно-инженерных машин». Это соревнование учредили в 2003 году в Массачусетском технологическом институте (Бостон, США). Школьники, студенты и аспиранты со всего мира и с разным академическим бэкграундом, начиная от журналистов и экономистов и заканчивая айтишниками и биологами, собираются в команды, в течение года работают над актуальной задачей и представляют свои проекты на осенней, финальной конференции Giant Jamboree. Конкурс iGEM уникален тем, что формирует открытое сообщество людей, которые обмениваются друг с другом и миром своими наработками. Выгодно отличают конкурс также комплексность и разноплановость проектов: упор делается на применение инженерных принципов и подходов, использование методов моделирования, обсуждение и проработку проекта с потенциальными пользователями и экспертами из разных областей (науки, бизнеса, права, государственного управления и т.д.). Образовательная деятельность, популяризация наук, налаживание между учеными и обществом мостов с целью обсуждения актуальных проблем — все это тоже входит в задачи команды. В этом году из-за пандемии конкурс проходил онлайн. Ядро нашей команды составляли студенты биологического факультета МГУ, которые получили бесценный опыт и выиграли золотую медаль. Однако подробнее об iGEM мы поговорим с вами в следующий раз [39].

Работа в команде

В конце марта 2020 года команда Moscow 2019 собрала новый состав для участия в конкурсе iGEM (рис. 5). Тогда впервые встретились незнакомые друг другу люди с общим желанием — создать проект в области синтетической биологии, который мог бы что-то изменить в мире.

Идея нашего проекта появилась только спустя полтора месяца, в начале мая. iGEM предлагает полную тематическую свободу: можно делать хлеб из дрожжей на Марсе, очищать воду бактериями, синтезировать натуральную краску для волос или разрабатывать системы мониторинга заболеваний. На выбор темы для нашего проекта сильно повлиял руководитель команды, Алексей Константинович Шайтан. Его лаборатория использует в работе системы CRISPR-Cas, а на их основе можно создавать детекторы заболеваний. Пандемия COVID-19 только начиналась, но уже было ясно, что SARS-CoV-2 необходимо выявлять быстро, массово и с высокой точностью. Так мы и создали наш проект — с целью детектировать генотипы коронавируса.

Очень важное требование конкурса — актуальность разработки. Другими словами, важно было понять, что наш проект нужен людям и его будут использовать. Этим проекты iGEM сильно отличаются от рутинной работы научных лабораторий. Именно поэтому мы встречались с экспертами, писали письма главному эпидемиологу Министерства здравоохранения, Николаю Ивановичу Брико, размещали посты в социальных сетях. Обратная связь полностью изменила наш проект: HaploSense переориентировался на детекцию генотипов вируса гепатита С.

С другой стороны, важен был сам детектор — как он будет работать, выглядеть, сможем ли мы его вообще собрать. Здесь нам на помощь пришел спонсор, компания BIOCAD. Эксперты компании консультировали нас относительно идеи проекта и ее реализуемости в столь короткие сроки. Они рассказали нам, как готовить патенты и выводить продукт на рынок. А это далеко не простые процессы.

В результате мы проанализировали гору тематической литературы, смогли придумать целостную систему на основе технологий CRISPR-Cas, провели ее моделирование и биоинформатический анализ.

Надо сказать, что организаторы iGEM помогают командам на протяжении всего пути: устраивают семинары, знакомят со специалистами, создают удобные платформы. А особенно поддерживают взаимодействие между командами. Все полгода мы общались и встречались с мотивированными ребятами из Америки, Эстонии, Индии, Франции, Германии и России (в этом году в конкурсе участвовали две команды из нашей страны). После таких встреч мы понимали, что можем сделать хороший, качественный проект, даже будучи студентами.

Пандемия, конечно, сыграла свою роль в работе нашей команды: мы работали дистанционно и встречались друг с другом офлайн всего четыре раза. По-настоящему сплоченными мы стали, когда приблизились конкурсные дедлайны. Мы уложились в срок благодаря слаженной работе команды. Одному человеку было бы невозможно справиться: кроме разработки идеи проекта, моделирования и проведения экспериментов нам предстояло сделать сайт с описанием проекта, два видео о команде и работе, заполнить форму безопасности, написать обзор по теме, да и это еще не все. Именно поэтому проект iGEM — прежде всего командная работа.

Итоги конкурса подводятся осенью, в начале ноября, на Giant Jamboree — огромной конференции, где команды, профессора, лекторы и судьи собираются, чтобы обсудить проекты, подметить их сильные и слабые стороны, сформировать новые коллаборации и просто хорошо провести время. Это финал iGEM: проекты уже подготовлены, критерии конкурса соблюдены. Казалось бы, можно выдохнуть… Но здесь же команды встречаются с судьями — исследователями, которые будут оценивать проекты и детально их рецензировать. Мы, конечно, тоже общались с судьями (в этом году онлайн): в воскресенье, в 17:00, нас спрашивали, почему мы использовали LAMP, сколько тест-полосок будем применять, ну и много чего другого… А после нашу команду ждала неделя, полная лекций по синтетической биологии и общения с коллегами со всего мира, а также викторины по синтетической биологии и церемония награждения. В итоге мы выиграли золотую медаль и создали хороший проект, который продолжим развивать и, надеемся, доведем до состояния полноценной тест-системы, подходящей для обычных поликлиник.

Мы советуем всем молодым исследователям принимать участие в iGEM. Этот конкурс стал для нас лучшим событием 2020 года. Создать проект с нуля возможно, нужно только желание!

1. Peter Forster, Lucy Forster, Colin Renfrew, Michael Forster. (2020). Phylogenetic network analysis of SARS-CoV-2 genomes. Proc Natl Acad Sci USA. 202004999;
2. B Korber, WM Fischer, S Gnanakaran, H Yoon, J Theiler, et. al. Spike mutation pipeline reveals the emergence of a more transmissible form of SARS-CoV-2 — Cold Spring Harbor Laboratory;
3. Maria Pachetti, Bruna Marini, Francesca Benedetti, Fabiola Giudici, Elisabetta Mauro, et. al.. (2020). Emerging SARS-CoV-2 mutation hot spots include a novel RNA-dependent-RNA polymerase variant. J Transl Med. 18;
4. Bette Korber, Will M. Fischer, Sandrasegaram Gnanakaran, Hyejin Yoon, James Theiler, et. al.. (2020). Tracking Changes in SARS-CoV-2 Spike: Evidence that D614G Increases Infectivity of the COVID-19 Virus. Cell;
5. Liubov Kozlovskaya, Anastasia Piniaeva, Georgy Ignatyev, Alexey Selivanov, Anna Shishova, et. al.. (2020). Isolation and phylogenetic analysis of SARS-CoV-2 variants collected in Russia during the COVID-19 outbreak. International Journal of Infectious Diseases. 99, 40-46;
6. Maria Pachetti, Bruna Marini, Francesca Benedetti, Fabiola Giudici, Elisabetta Mauro, et. al.. (2020). Emerging SARS-CoV-2 mutation hot spots include a novel RNA-dependent-RNA polymerase variant. J Transl Med. 18;
7. Ashleigh Shannon, Nhung Thi-Tuyet Le, Barbara Selisko, Cecilia Eydoux, Karine Alvarez, et. al.. (2020). Remdesivir and SARS-CoV-2: Structural requirements at both nsp12 RdRp and nsp14 Exonuclease active-sites. Antiviral Research. 178, 104793;
8. Подсыпанина К. (2020). В России описан случай двойной инфекции у пациента с COVID-19. PCR.News;
9. Казимиров П. (2020). Нобелевская неделя 2020. Харви Альтер: «Это не только история борьбы с гепатитом. Это история моей жизни». PCR.News;
10. Donald B. Smith, Jens Bukh, Carla Kuiken, A. Scott Muerhoff, Charles M. Rice, et. al.. (2014). Expanded classification of hepatitis C virus into 7 genotypes and 67 subtypes: Updated criteria and genotype assignment web resource. Hepatology. 59, 318-327;
11. Гепатит C: решенная проблема?;
12. J. J. Germer, J. N. Mandrekar, J. L. Bendel, P. S. Mitchell, J. D. C. Yao. (2011). Hepatitis C Virus Genotypes in Clinical Specimens Tested at a National Reference Testing Laboratory in the United States. Journal of Clinical Microbiology. 49, 3040-3043;
13. Chun I. Yu, Bor-Luen Chiang. (2010). A New Insight into Hepatitis C Vaccine Development. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 1-12;
14. C. Zingaretti, R. De Francesco, S. Abrignani. (2014). Why is it so difficult to develop a hepatitis C virus preventive vaccine?. Clinical Microbiology and Infection. 20, 103-109;
15. Рекомендации по диагностике и лечению взрослых больных гепатитом С. (2017). Минздрав РФ;
16. Daniel Shouval. (2003). Hepatitis B vaccines. Journal of Hepatology. 39, 70-76;
17. Anna Kramvis, Michael Kew, Guido François. (2005). Hepatitis B virus genotypes. Vaccine. 23, 2409-2423;
18. A. Kramvis, M. C. Kew. (2005). Relationship of genotypes of hepatitis B virus to mutations, disease progression and response to antiviral therapy. J Viral Hepat. 12, 456-464;
19. JIA-HORNG KAO. (2002). Hepatitis B viral genotypes: Clinical relevance and molecular characteristics. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 17, 643-650;
20. Swati S. Gandhe, Mandeep S. Chadha, Vidya A. Arankalle. (2003). Hepatitis B virus genotypes and serotypes in western India: Lack of clinical significance. J. Med. Virol.. 69, 324-330;
21. José A Usme-Ciro, Jairo A Méndez, Katherine D Laiton, Andrés Páez. (2014). The relevance of dengue virus genotypes surveillance at country level before vaccine approval. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 10, 2674-2678;
22. Arunee Sabchareon, Derek Wallace, Chukiat Sirivichayakul, Kriengsak Limkittikul, Pornthep Chanthavanich, et. al.. (2012). Protective efficacy of the recombinant, live-attenuated, CYD tetravalent dengue vaccine in Thai schoolchildren: a randomised, controlled phase 2b trial. The Lancet. 380, 1559-1567;
23. Sol M. Cancel Tirado, Kyoung-Jin Yoon. (2003). Antibody-Dependent Enhancement of Virus Infection and Disease. Viral Immunology. 16, 69-86;
24. Rafael Sanjuán, Miguel R. Nebot, Nicola Chirico, Louis M. Mansky, Robert Belshaw. (2010). Viral Mutation Rates. JVI. 84, 9733-9748;
25. Много — не значит хорошо: «Ультрикс», «Гриппол», «Совигрипп» — что выбрать?;
26. Базыкин Г. (2016). Грипп: эволюция вируса и универсальная вакцина. «Постнаука»;
27. Yo Han Jang, Baik-Lin Seong. (2012). Principles underlying rational design of live attenuated influenza vaccines. Clin Exp Vaccine Res. 1, 35;
28. Emmie de Wit, Neeltje van Doremalen, Darryl Falzarano, Vincent J. Munster. (2016). SARS and MERS: recent insights into emerging coronaviruses. Nat Rev Microbiol. 14, 523-534;
29. 12 методов в картинках: клеточные технологии;
30. Muhammad Amjad, Varsha Moudgal, Muhammad Faisal. (2013). Laboratory Methods for Diagnosis and Management of Hepatitis C Virus Infection. Lab Med. 44, 292-299;
31. 12 методов в картинках: иммунологические технологии;
32. 12 методов в картинках: полимеразная цепная реакция;
33. Belén Fernández-Caso, Jose Ángel Fernández-Caballero, Natalia Chueca, Eukene Rojo, Adolfo de Salazar, et. al.. (2019). Infection with multiple hepatitis C virus genotypes detected using commercial tests should be confirmed using next generation sequencing. Sci Rep. 9;
34. Просто о сложном: CRISPR/Cas;
35. LymeExpress — студенты в борьбе с клещевыми инфекциями;
36. Eugene V Koonin, Kira S Makarova, Feng Zhang. (2017). Diversity, classification and evolution of CRISPR-Cas systems. Current Opinion in Microbiology. 37, 67-78;
37. Cameron Myhrvold, Catherine A. Freije, Jonathan S. Gootenberg, Omar O. Abudayyeh, Hayden C. Metsky, et. al.. (2018). Field-deployable viral diagnostics using CRISPR-Cas13. Science. 360, 444-448;
38. Поиск иголки в стоге сена за 10 минут — подсвети себе LAMPой;
39. Российское золото iGEM 2020.

01.03.2021

Вирусология занимает важное место среди биологических дисциплин. Современный медицинский или ветеринарный специалист должен знать не только клинико–патологическую сторону заболевания, но и иметь четкое представление о вирусах, их свойствах, методах лабораторной диагностики и свойствах постинфекционного и поствакцинального иммунитета.

Вирус (от лат. virus — яд) является простейшей неклеточной формой жизни в виде микроскопической биологической частицы, представляющей собой молекулы нуклеиновых кислот (ДНК или РНК), заключённых в защитную белковую оболочку (капсид) и способные инфицировать живые организма.

 Вирусы являются облигатными внутриклеточными паразитами человека, животных, растений, насекомых, бактерий, грибов, простейших и других живых существ и изменяют свои свойства как в естественных условиях размножения, так и в экспериментах. Наследственные изменения свойств вирусов могут быть основаны на двух процессах:

1. мутации, то есть изменении последовательности нуклеотидов в определенной области генома вируса, что приводит к фенотипически выраженному изменению свойства;
2. рекомбинации, то есть обменом генетическим материалом между двумя вирусами, близкими, но различными по наследственным свойствам.

Значительная часть известных человеку вирусов имеют свои особые морфофункциональные и патогенные свойства, чем и вызывают вирусные заболевания у животных и людей. Среди таковых выделяют ДНК- и РНК-содержащие вирусы.

Мутации у вирусов

Мутация — это изменчивость, связанная с изменениями в самих генах. Она может быть прерывистой, скачкообразной и приводить к стойким изменениям наследственных свойств вирусов. Все вирусные мутации делятся на две группы:

• спонтанные;
• индуцированные (вызванные).

По своей протяжённости они делятся на точечные и аберрационные (изменения, затрагивающие значительную часть генома).
Точечные мутации вызываются замещением одного нуклеотида (для РНКсодержащих вирусов). Такие мутации иногда можно обратить вспять с восстановлением первоначальной структуры генома. Однако мутационные изменения могут захватывать большие части молекул нуклеиновых кислот, то есть несколько нуклеотидов. Также в этом случае может происходить выпадения, вставки и перемещения (транслокация) целых участков и даже повороты участков на 180° (так называемая инверсия), смещения каркаса считывания – более крупные перестройки в структуре нуклеиновых кислот, а следовательно, нарушение генетической информации.

Но точечные мутации не всегда приводят к изменению фенотипа. Существует целый ряд причин, по которым такие мутации не могут проявляться. Одна из них — вырождение генетического кода. Код синтеза белка вырождается, что означает, что некоторые аминокислоты могут быть закодированы несколькими триплетами (кодонами). Например, аминокислота лейцин может быть закодирована шестью триплетами. Поэтому, если молекула РНК заменяет триплет ЦУУ на ЦУЦ, ЦУА на ЦУГ, то синтезированная молекула белка все еще будет содержать аминокислоту лейцин.

Поэтому ни структура белка, ни его биологические свойства не нарушаются. Природа использует своего рода синонимичный язык и, заменяя один кодон другим, закладывает в них одно и то же понятие (аминокислоту), тем самым сохраняя естественную структуру и функцию синтезируемого белка.

 Другое дело, если аминокислота кодируется только одним триплетом, например, синтез триптофана кодируется и заменяется только триплетом УГГ, то есть синонимом, который отсутствует. В этом случае в белок включается еще одна какаялибо аминокислота, которая может привести к появлению мутантного признака.

Аберрация в фагах вызвана делециями (потерями) различного числа нуклеотидов, от одной пары до последовательности, вызывающей одну или несколько функций вируса. Как спонтанные, так и индуцированные мутации также делятся на прямые и обратные мутации. Мутации могут иметь разные последствия. В некоторых случаях они приводят к изменению фенотипических проявлений в нормальных условиях.

Например, увеличивается или уменьшается размер бляшек под агарным покрытием; увеличивается или ослабевает вирулентность для определенного вида животных; вирус становится более чувствительным к действию химиотерапевтического агента и т. д.

В других случаях мутация является фатальной, поскольку она нарушает синтез или функцию жизненно важного вирусного белка, например, такого как вирусная полимераза. В некоторых случаях мутации являются условно летальными, так как вирусспецифический белок сохраняет свои функции при определенных условиях и теряет эту способность в неразрешающих (непермиссивных) условиях.

Типичным примером таких мутаций являются термочувствительные – ТS-мутации, при которых вирус теряет способность к размножению при повышенных температурах (+39-42°С), сохраняя эту способность при нормальных температурах роста (+36-37°С). Морфологические или структурные мутации могут влиять на размер вириона, первичную структуру вирусных белков и изменения в генах, определяющих ранние и поздние вирусные ферменты, обеспечивающие размножение вируса. Мутации также могут быть различными по своему механизму.

В одних случаях происходит делеция, то есть потеря одного или нескольких нуклеотидов, в других — встраивание одного или нескольких нуклеотидов, а в некоторых случаях один нуклеотид заменяется другим. Мутации могут быть прямыми или обратными. Прямые мутации меняют фенотип, а обратные мутации – реверсии) — восстанавливаются. Реальная реверсия возможна, когда обратная мутация происходит вместе с первичным повреждением, и псевдореверсия, когда мутация происходит в другой области дефектного гена (интрагенное торможение мутации) или в другом гене (экстрагенное подавление мутации).

Реверсия — не редкое явление, потому что ревертанты обычно лучше приспособлены к данной клеточной системе. Поэтому при создании мутантов с определенными свой ствами, например, вакцинных штаммов, следует ожидать возможного превращения их в дикий тип. Вирусы отличаются не только своими небольшими размерами, селективной способностью к размножению в живых клетках, особенностями строения наследственного вещества, но и значительной изменчивостью от других представителей живого мира.

Изменения могут влиять на размер, форму, патогенность, антигенную структуру, тканевую тропность, устойчивость к физико-химическим воздействиям и на другие свойства вирусов. Значение причин, механизмов и характера изменений имеет большое значение при получении необходимых вакцин для вирусных штаммов, а также для разработки эффективных мер борьбы с вирусными эпизодами, в ходе которых, как известно, свойства вирусов могут существенно изменяться.

Мутация вирусов может происходить в результате химических изменений цистронов или нарушения последовательности их расположения в структуре молекулы вирусной нуклеиновой кислоты. В зависимости от условий различают естественную изменчивость вирусов, наблюдаемую в нормальных условиях размножения, и искусственную изменчивость, получаемую в результате многочисленных специальных пассажей или воздействия на вирусы определенных физических или химических факторов (мутагенов). В обычных природных условиях изменчивость проявляется не во всех вирусах одинаково.

Этот признак наиболее заметен у вируса гриппа и вирус ящера. Значительная изменчивость отмечается у вируса гриппа. Об этом свидетельствует большое количество вариантов у разных типов этих вирусов, а также значительные изменения его антигенных свойств в конце почти каждой эпизоотии.

Частота мутаций и механизмы их возникновения

Мутации бактериофагов изучались очень интенсивно не только с целью генетического анализа, но и с целью получения информации о свойствах самих фагов. Частота появления мутантов в потомстве фагов варьируется очень сильно: например, одни мутанты образуются с частотой не более 10, а другие-с частотой 10 и выше. Неблагоприятное воздействие высокочастотных мутаций обычно компенсируется эффектом отбора. Например, мутантный фаг может быть заменен диким типом, что дает более высокий выход фага. Высокая частота вспышек обычно характерна для таких мутаций, которые могут происходить как во многих локусах, так в одном и том же локусе.

В тех случаях, когда нормальный признак соответствует функциональной форме гена, а мутант появляется в результате изменения в любой точке локуса, частота прямых мутаций окажется выше, чем частота обратных мутаций, так как обратные мутации должны приводить к восстановлению нормального состояния. Иногда ревертанты на самом деле являются псевдоревертантами: это происходит либо из-за изменений в другом гене (мутации-супрессоры), либо из-за изменений в том же гене, которые вызывают другую, но также активную форму продукта.

У зрелых фагов частота спонтанных мутаций очень мала, но они могут быть индуцированы под влиянием таких мутагенных факторов, как рентгеновские или ультрафиолетовые лучи, азотистая кислота, гидроксиламин или алкилирующие агенты. Азотистая кислота дезаминирует основания нуклеотидов, а этилметилсульфат их этилирует. Гидроксиламин превращает шитозин в урацил. В результате ошибок, допущенных при репликации химически модифицированной нуклеиновой кислоты, происходят мутации, и потомство фагов, полученное из бактерии, содержит как нормальные, так и мутантные частицы. Однако, как и при обработке мутагенного фага, содержащего одноцепочную ДНК, образуется чистый мутантный клон.

Изучение мутационного процесса, происходящего при размножении фагов, непосредственно связано с анализом развития фагов. Давайте рассмотрим процесс спонтанной мутации. В бактериальной клетке, в которой произошла мутация фага, 6 образуются как нормальный, так и мутировавший фаги. Количество мутантных фаговых частиц, содержащихся в популяции фагов, происходящих из этой отдельной бактериальной клетки, очевидно, определяется характером размножения фагов, поскольку новые гены могут быть сформированы только путем репликации уже существующих. Если вероятность мутации одинакова для каждой репликации, то число мутантов зависит от механизма репликации.

Например, если каждая новая копия гена формируется независимо от других, то распределение мутантных копий в потомках фагов от разных инфицированных бактерий будет случайным. Если же, наоборот, каждая из полученных копий воспроизводится, то в свою очередь мутантные копии будут разделены на группы или клоны, состоящие из мутантных «сибсов».

Индуцированные хозяином модификации бактериофагов

Помимо мутаций, бактериофаги подвержены негенетическим изменениям, в которых главная роль принадлежит клетке-хозяину. Это явление было названо модификациями, вызванными хозяином. Значение этих модификаций для молекулярной биологии состоит в том, что они показали способность внутриклеточной среды вызывать такие изменения в химической структуре генетического материала, которые могут быть использованы для идентификации клеточных линий, синтезирующих ДНК.

Подобные явления были впервые обнаружены на фаговой ДНК, но они также справедливы и для каждой бактериальной клеточной ДНК. Есть также наблюдения, при которых это явление относится и к эукариотическим клеткам. В особых случаях могут возникнуть более сложные ситуации. Двустороннее ограничение фага двумя хозяевами иногда наблюдается, но оно не обязательно. Фаги, отторгнутые клетками, способны адсорбироваться на них и проникать в их ДНК добавляя часть собственной ДНК. Однако последняя часть быстро разрушается, и репликация не происходит.

Деградация ДНК вызывается специфическими эндонуклеазами (рестриктазами или R-нуклеазами), которые могут обнаруживать и расщеплять определенные участки ДНК, если они не были модифицированы под влиянием М-ферментов. После этого ДНК расщепляется экзонуклеазами на отдельные нуклеотиды. Бактериальный штамм может иметь одну или несколько R-нуклеаз и в то же время M-ферменты, которые защищают собственную ДНК клетки. Предложена удобная номенклатура этих ферментов. Согласно ряду данных, области детекции R-нуклеазы не всегда совпадают с областями расщепления ДНК; возможно, что фермент может мигрировать по цепочке до того, как найдет область, где происходит расщепление ДНК. Функциональная роль индуцированных хозяином модификаций неясна.

Они способны защитить этот штамм бактерий от массового уничтожения фагами, растущими на различных бактериях. В более общем плане роль модификаций можно определить как защиту от проникновения неприемлемой чужеродной ДНК в бактериальную клетку и ее последующего «приживления». Бактерия А, которая отвергает фаги, размноженные на штамме В, также отвергает ДНК бактерии В, когда она вводится путем конъюгации или трансдукции.

Как видим, мутирование вирусов проходит достаточно сложный и тернистый путь в приобретении новых вирулентных свойств. Эти свойства могут быть как ослабляющими для развития инфекционного процесса, так и крайне агрессивными в своём новом виде.

Мы, паразиты, — складные ножи человечества

Непосвященным трудно понять вирусную философию: наблюдая и изучая вирусы, люди, жаждущие абсолютной этичности и стремящиеся к непреложной истине, сталкиваются с серьезными препятствиями. Тем не менее на протяжении столетий настойчивость позволяет им двигаться вперед. Латинское слово «вирус» означает токсин, яд: такая этимология доказывает, что поначалу нас относили к слишком обширной категории, в которую включали любой агент, невидимый невооруженным глазом и вызывающий болезнь, будь то бактерия, грибок или другой микроскопический организм. Жажда знаний помогла вам открыть третий глаз — микроскоп, позволивший проникнуть в ранее невидимый мир мельчайших инфекционных одноклеточных организмов — бактерий. Позже с помощью еще более сильных измерительных приборов вы смогли увидеть нас и поразиться гармоничным геометрическим формам и нашей беспрецедентной способности к консервации и распространению. Вирусы можно причислить к настоящим паразитам, поскольку важнейшим источником жизни нам служат хозяева и без них наше существование и размножение невозможны — ведь сами мы не способны ни производить, ни даже собирать и хранить необходимую нам энергию. Тем не менее мы состоим из белков и генетического материала, представленного молекулами ДНК или РНК. Эта совокупность, казалось бы, противоречивых характеристик делает нас поистине мистической загадкой: живые ли мы существа? Неуловимость нашей природы завела вас в непроходимые дебри сомнений по поводу самой нашей жизни: означает ли отсутствие у нас необходимых жизненных элементов то, что они были утрачены нашими предками, или, наоборот, ставит под вопрос саму границу между неодушевленными молекулами и живыми организмами? Время философских откровений еще не пришло, но исследования и наблюдения за нашими тайнами уже привели вас к многим свершениям, столь же конкретным, сколь и важным для собственного вашего выживания!

В первую очередь это касается современной медицины, многим обязанной знанию о том, как мы функционируем. Изобретение вакцин стало следствием глубокого понимания природы конфликта и осознания того, какую пользу можно извлечь из объединения противоборствующих сил. Вам удалось заглянуть вглубь и нас, и себя, чтобы понять, как лучше подготовить иммунную систему к возможной атаке. Тот же прием использования конфликта в собственных интересах был применен для разработки ваших первых антибиотиков, в частности пенициллина. Наблюдая за войной между бактериями и плесенью, вы обнаружили вещество, выделяемое плесенью рода Penicillium, которое подавляет рост бактерий. К сожалению, злоупотребление этим биологическим оружием отразилось на естественном отборе враждебных бактерий и привело к распространению мутантных штаммов, способных противостоять одному, нескольким или вообще всем антибиотикам из вашего арсенала.

Коль скоро плесень подвела вас в борьбе с бактериями, мы могли бы прийти на помощь. Чувствую, как вас охватывает первозданный страх. Доверять вирусам, этим природным паразитам? Тем не менее непредубежденные ученые заинтересовались нашей враждой с иными видами, нежели человек: с бактериями. В начале XX века два микробиолога, англичанин Фредерик Туорт и француз Феликс д’Эрелль, независимо друг от друга открыли вирусы, способные уничтожать бактерии, — бактериофаги. Во время Первой мировой войны Феликс д’Эрелль обнаружил его в испражнениях солдат в стадии ремиссии после дизентерии. Этот свободомыслящий французский врач предположил, что бактериофаги могут стать эффективным средством борьбы с бактериальными инфекциями, такими как дизентерия. Прежде чем испробовать лечение на больных дизентерией и холерой, д’Эрелль доказал безопасность предлагаемого метода, сначала приняв внутрь культуру бактериофагов, а затем вколов их себе подкожно. Ремиссия, наблюдавшаяся у пациентов после такого лечения, его обнадежила: так родилась фаговая терапия. Успехи электронной микроскопии позволили получить портрет этих странных вирусов: головка геометрической формы, именуемая капсидом, состоящая из белков и содержащая геном вируса (молекулу ДНК или РНК), и цилиндрическая структура, окруженная нитевидными ножками. Если вдуматься, бактериофаги имеют вид инопланетного модуля, прилетевшего из космоса с целью уничтожения землян! В данном случае мишенью служат бактерии: вирус ведет себя как шприц для подкожных инъекций, прокалывая стенки бактерий и впрыскивая свой генетический материал, где содержится инструкция, необходимая для его размножения. Чаще всего это приводит к гибели его бактериального хозяина. Похоже, история этой вирусной атаки вдохновила сценаристов множества ваших фантастических фильмов!

Но сенсационный способ, которым бактериофаги заражают бактерии, и эффективность этого бактериального геноцида, очевидно, впечатлили не весь мир. Зарождающаяся фаговая терапия не устояла перед повальным увлечением антибиотиками и их догматизацией в западной медицине. Фаговая терапия сегодня скорее ассоциируется с восточными лечебными практиками, точнее, ближнеближневосточными, потому что ими пользуются в странах Восточной Европы из бывшего советского блока, где бактериофаги все еще применяют для лечения различных бактериальных инфекций. Эти методы лечения пока не одобрены за пределами России, Польши и Грузии, но многие больные совершают паломничество в эти страны для избавления от недугов, не излечимых другим способом. Возможно, бактериофаги станут вашими союзниками в такой вовсе не холодной войне против бактериальных штаммов, мультирезистентных к антибиотикам… Тем более что эволюция позаботилась о союзе людей и бактериофагов задолго до вашей современной медицины. Недавно ученые обнаружили, что кишечная слизь большинства животных от природы насыщена бактериофагами. Не исключено, что между животными и вирусами существует древняя связь, а бактериофаги даже могут быть компонентами иммунной системы.

Биологическое оружие, которым мы пользуемся в войнах с другими видами, вдохновило людей не только на создание лекарств. Они превратили его в ультрасовременные научные инструменты, чтобы те помогали им в поисках истины. Подобно анатомам, исследующим структуру, функции и тайны плоти при помощи ножниц и скальпелей, молекулярный биолог, чтобы изучать и анализировать геном, нуждается в инструментах, только совершенно иного размера. Поле боя между бактериофагами и бактериями стало для биологов источником самых невероятных инструментов. Давайте проведем инвентаризацию арсеналов каждой из воюющих сторон.

Для размножения вирус-бактериофаг вводит в бактерию свой генетический материал, частичку ДНК или РНК, вынуждая ее следовать инструкциям вирусного генома и производить новые вирусы. Но бактерии, изобилующие сегодня на поверхности планеты, обычно бывают потомками штаммов, которые издавна вступали с нами в схватки и создали страшное оборонительное оружие. Особенно эффективны их ферменты-ножницы — рестрикционные ферменты, способные нацеливаться на небольшие последовательности в ДНК определенных бактериофагов, чтобы их искромсать. Собственный геном бактерия защищает от рестриктаз с помощью метки, поставленной другими ферментами, метилазами, которые, как шаманы, окружают свои святилища охранительной магией и отдают ферментам-ножницам приказ удовлетворять свою страсть к разрушению в другом месте. Восхищенные этой генной инженерией, ученые взяли на вооружение все молекулярные инструменты, и те, что режут, и те, что метят, и те, что склеивают, копируют и обменивают… С их помощью они копаются в ДНК и производят манипуляции в своих пробирках, подобно анатомам, склоняющимся над секционным столом.

Но особенно пригодилась ученым наша гибкость йогов, позволяющая ради воспроизводства нашего генома в клетках-хозяевах проникать сквозь, казалось бы, непреодолимые барьеры. Некоторые из наших молекул умеют выключать молекулярный шум в клетках-хозяевах, заставляя их сконцентрироваться и войти в медитативный транс, посвятив себя исключительно нашей репликации. Другой метод основан на принципе путешествия в астрал: мы сливаем наш генетический материал с материалом клетки-хозяина и вводим себя в своего рода самогипноз. Когда во время этого короткого момента релаксации хозяйская клетка делится, вместе с ее собственной копируется и наша ДНК. Через некоторое время наш маленький геном реактивируется и покидает геном хозяина, чтобы образовать новые вирусные частицы, которые продолжат паломничество к соседним клеткам. Вставка нашего генетического материала в геном хозяина иногда приводит к нежелательным последствиям, например к неприглядным разрастаниям на теле кроликов и людей, о чем уже говорилось в главе IV. Но эта наша способность дала исследователям возможность экспериментировать с живыми клетками: вводить в них чужеродную ДНК, изменять их функционирование, вставлять ДНК в их геном… Можно сказать, что мы, вирусы, служим молекулярным складным ножом, которым вот уже несколько десятилетий вы пользуетесь, чтобы генетически видоизменять бактерии, растения и животных с целью лучше понять их функционирование.

Оснащенные этими потрясающими инструментами, молекулярные биологи постепенно расшифровывают эзотерические сообщения, скрытые в генетической памяти живых организмов. Но их попытки менять геном подчас приводят к неожиданным последствиям. Пользоваться молекулярными ножницами вне пробирки совсем не легко, к тому же интеграция вируса в ДНК другого организма плохо поддается контролю. Проблема в том, что наш геном, иногда несколько его копий, вставляется в случайные места генома клетки-хозяина. Нам-то хаос нипочем, но такое положение дел, видимо, противоречит вашей потребности в порядке и дисциплине. Поэтому вы долго искали инструменты, пригодные для генной инженерии. И снова именно вооруженный конфликт между бактериофагами и бактериями позволил вам в 2012 году получить высококачественную модель бактериальных ножниц — систему CRISPR/Cas9.

Как мы видели, ферменты рестрикции представляют собой эффективную, но не слишком лабильную систему: они способны распознавать строго определенные мотивы в последовательности ДНК, а значит, бактериофаги, в чьем геноме такие мотивы отсутствуют, не боятся бактериальных атак. Между тем некоторые бактерии выработали другой инструмент, позволяющий атаковать практически любое место в вирусном геноме бактериофага. При заражении вирусами эти бактерии вставляют небольшие фрагменты вирусного генома в определенные места своей собственной ДНК, называемые CRISPR. Эта область ДНК транскрибирует вирусный геном в РНК, мессенджерную форму генетического кода, которая обычно служит матрицей для синтеза белков. Только в данном случае вирусная РНК отправляет сигнал режущим ферментам-убийцам Cas9. Последние терпеливо ждут информации и, как только обнаруживают фрагменты РНК, несущие копии участков вирусного генома, переходят в атаку. Они узнают бактериофаг, присоединяются к нему и отрывают ему баш… э-э-э… наше дзен-сознание предпочитает проигнорировать этот образ.

Если позже бактерия заражается новыми вирусами, она расширяет свой репертуар CRISPR, и ее собственный геном модифицируется для включения целого каталога геномных фотороботов бактериофагов, подлежащих уничтожению. Очевидно, иммунная система у нее адаптивная, и, поскольку новые данные включены в наследственный материал, бактерия передает потомству весь свой арсенал, наработанный за время столкновений с вирусами-бактериофагами.

Ученые приветствовали это ультрасовременное оружие, а когда поняли, что механизм CRISPR можно перепрограммировать так, чтобы мишенью становилась практически любая последовательность ДНК, вирусная или нет, пришли в полный восторг. Используя кусочек РНК и режущий фермент Cas9, люди сегодня могут сравнительно легко модифицировать геном по своему усмотрению. Будем надеяться, что они сумеют разумно распорядиться этой огромной силой, позаимствованной у сторон паразитарного конфликта, в котором сами они не участвовали. Мы манипулировали геномом миллиарды лет, и я позволю себе процитировать мудрые слова духовного гуру вирусов: «Чем больше сила, тем больше и ответственность». Пусть они отзовутся в ваших душах и направят вас на путь перерождения.

Из всех объектов ваших генетических манипуляций вас особенно занимают растения, потребляемые вами в пищу, а также сельскохозяйственные животные. Что и говорить, людям трудно понять феномен межвидового альтруизма и смириться с тем, что насекомые атакуют их зерновые, фрукты и овощи, а вредители уничтожают посевы. Генетическая модификация этих растений — один из способов сделать их более стойкими. Вслед за паразитической осой, поведавшей о своем образе жизни в главе II, вы одомашниваете паразитов для борьбы с вредителями, истребляющими ваши посевы. Правда, использование паразитизма вы предпочитаете называть борьбой с паразитами. Чтобы защитить свои поля и сады от паразитов, вы постоянно опыляете их личинками паразитических ос, чья способность пожирать гусениц изнутри привела вас в ужас, или личинками внутритканевых нематодных червей, за несколько дней убивающих травоядных насекомых: такие пестициды не загрязняют окружающую среду.

Французы стали пионерами в применении биологической защиты растений. Когда предмету их национальной гордости, вину, в XIX веке угрожала тля филлоксера, уничтожавшая виноградную лозу, они использовали клещей, естественных врагов этой тли. Увы, для сдерживания филлоксеры этого оказалось недостаточно, но этот опыт позволил вам оценить огромный потенциал паразитизма для защиты сельскохозяйственных растений. Поэтому сегодня для борьбы с инвазивными видами насекомых вы регулярно обращаетесь к паразитам, к примеру, мухам-форидам, чьи личинки, обезглавливающие огненных муравьев, в главе III приводили в ужас рассказчика (о котором, кстати, у нас до сих пор нет никаких известий). Некоторые паразитоидные нематоды, такие как Phasmarhabditis hermaphrodita, помогают вам в войне против слизней, опустошающих огороды. Эти черви искусно манипулируют поведением своего хозяина, побуждая его хоронить себя заживо, прежде чем погибнуть от рук нематоды. А некоторых паразитов вам и просить не приходится, они сами охотно помогают вам бороться с вредителями. Токсоплазма, поражающая крыс, заставляет их пренебрегать опасностью, из-за чего они чаще попадают в ловушки или в кошачьи когти!

На самом деле суть такой паразитарной биологической защиты чаще всего заключается в восстановлении нарушенного естественного баланса. Вредители сельскохозяйственных культур — как правило, организмы, которые искусственным путем были внедрены в непривычную среду, где их естественные враги и паразиты отсутствовали. Природный баланс может быть восстановлен благодаря агентам биоконтроля, но для этого необходимо уважать паразитизм и понимать его экологическое значение. Сегодня многие фермеры добиваются этого, сажая, например, дзен-сады с биологическими коридорами, где их помощники-паразиты могут разместить свои биологические ниши.

Приобрести книгу можно по ссылке

Больше текстов о науке и обществе — в нашем телеграм-канале «Проект “Сноб” — Общество». Присоединяйтесь 

Вам может быть интересно:

• Гонки на вакцинах. Кто не хочет прививаться, почему и что с этим делать
• Можно ли брать грех на душу ради благополучия своего единственного ребенка?
• Живее всех живых. Цой на сцене и в плейлисте актеров театра «Современник»

Враг №2: активные формы кислорода Самый распространенный мутаген. Хитрость заключается в том, что эти активные формы генерируются в ходе самых обычных химических реакций, которые протекают в человеческом теле. Тут может возникнуть недоумение, ведь кислород — это газ, который содержится в атмосфере нашей планеты, с ним ассоциируется дыхание полной грудью, свежесть и еще какие-то приятные ощущения из рекламы стиральных порошков.

Разгадка кроется в названии. Кислород окисляет вещества, которые встречает на своем пути. Вспомните перекись водорода, которую выливают на разбитую коленку — примерно то же самое происходит в клеточных масштабах при выделении активных форм кислорода. Активные формы кислорода разрушают мембраны, из которых построены живые клетки, выдергивают отдельные основания из цепи ДНК и вносят разрывы. Страшно не только то, что они делают, но и то, как изощренно это происходит. Поскольку выделение АФК осуществляется постоянно, при поломке нейтрализующего их механизма клетки постоянно подвергаются бомбардировке мутагенами и гибнут в муках.

Доказано: от окисления и активных радикалов спасают антиоксиданты. Это вещества, которые содержатся в свежих ягодах и фруктах, зеленом чае, орехах и красном вине. Они переводят радикалы в неактивную форму. Иными словами, антиоксиданты — это такие альтруисты. Они выходят на улицу, видят, как хулиганы разрушают стены, и принимают удар на себя. Антиоксиданты обладают множеством чудесных свойств, одно из которых — защита от старения. Согласно некоторым гипотезам, старение ассоциировано с выделением АФК. Отдельно выделяется легион — витамин Е — собирательное название для нескольких жирорастворимых веществ, обладающих антиоксидантной активностью. При поступлении в пищеварительную систему ингредиенты витамина Е проходят отбор в печени, и уже в круг обмена веществ вступает в основном альфа-токоферол.

Важно учитывать собственную генетическую предрасположенность к усвоению витаминов, так как антиоксиданты при чрезмерном потреблении вредны: они могут препятствовать усвоению других микроэлементов.

Враг № 3: афлатоксины. Название принадлежит группе ядов-канцерогенов, вырабатываемых некоторыми видами плесени. Афлатоксины — это ответ на детский вопрос: «Почему нельзя есть землю и опавшие листья?», на взрослый вопрос: «Почему у чая есть срок годности?» и на старческий вопрос: «Почему нельзя есть заплесневевшую крупу?» Когда условия хранения не соблюдаются, на продукте, как на питательной среде, растут плесневые грибы рода Aspergillus. Опасность может подстерегать в крупах, специях, орехах, чае, молоке, яйцах, мясе, сухофруктах, хлебе и промышленных соках. Плесень может вырасти в результате неправильного или длительного хранения, а ароматизирующая добавка заглушит неприятный запах. Если доза афлатоксинов не смертельная, но регулярная, это может послужить причиной для развития цирроза и рака печени. Особую опасность продукты с афлатоксинами представляют для будущих матерей: помимо общего отравления, афлатоксины могут нарушить эмбриогенез.

Доказано: полезные пищевые привычки помогут избежать этого врага. Будьте аккуратны и не ешьте просроченные продукты. Старайтесь тщательно мыть продукты и готовить еду непосредственно перед употреблением. Впрочем, люди с непереносимостью глютена, лактозы или кофеина в отношении афлатоксина чувствуют себя немного спокойнее: больше половины продуктов из группы риска уже исключены из их меню. Такая особенность пищевого поведения, как привычка переедать, может быть вдвойне вредна в данной ситуации.

Враг №4: бензол. Бензол — химическое соединение, без которого невозможно представить современную жизнь. Это токсин и канцероген, который входит в состав нефти и бензина, а также широко применяется в производстве лекарств, пластмасс, резины и красителей. Если поместить человека в замкнутое пространство и постепенно закачивать туда бензол, то сначала он почувствует эйфорию. Затем появятся сонливость, тошнота, головная боль, мышечные подергивания. Если оставить испытуемого в этой камере на длительное время, то он умрет, если же его выпустить, то можно будет наблюдать целый комплекс расстройств, вызванных отравлением бензолом. Однако нам интересно не это. Бензол часто встречается в некачественной косметической продукции и пластмассовых изделиях, то есть не исключено систематическое отравление бензолом в небольших количествах, что может провоцировать возникновение различных видов гемато-онкологических заболеваний.

Доказано: витамины группы В — Ниацин, фолат и кобаламин — необходимы для репарации ДНК. Дефицит этих витаминов в первую очередь заметен при отравлении бензолом. Зачастую люди получают витамины этой группы с мясом животных. Подробнее узнать о том, на какие процессы влияют витамины группы В и как диагностировать их недостаток, можно по ссылке.

Берегите себя. Враги в лице мутагенов могут быть повсюду. Когда речь заходит о здоровом образе жизни, тем, кто пытается изменить все своими силами, приходится балансировать между массой советов и здравым смыслом. Граница зыбкая и устоять на ней больше шансов у того,, кто знает себя и не наносит себе вред.

Что на роду написано, того не миновать?
Редактирование генома в терапии наследственных заболеваний

Наследственность – это своего рода фатализм нашего времени. Расшифровка последовательности ДНК сродни предсказанию судьбы человека. Нам говорят, что гены определяют все: от цвета глаз до склонности к девиантному поведению. Добавьте к этому болезни, передающиеся по наследству, и мутации, связанные с риском развития таких болезней, как рак. Но можно ли пойти наперекор зловещему року и изменить судьбу, записанную на «скрижалях» ДНК? Да, это возможно, и если не сегодня, то в недалеком будущем. Генетическая инженерия занимается этими проблемами уже несколько десятков лет, однако в последние годы вокруг редактирования геномов возник особый ажиотаж. Что же изменилось? Ответ на этот вопрос – аббревиатура CRISPR/Cas

Все началось в 1987 г., когда в бактериальной ДНК были обнаружены странные нуклеотидные повторы, разделенные небольшими участками уникальных последовательностей. Спустя десять лет было показано, что эти повторенные последовательности, названные CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), являются системой адаптивного иммунитета бактерий – ​способом защиты против чужеродной ДНК, в частности, против бактериальных вирусов (бактериофагов).

Но какое отношение имеет это к наследственным болезням человека? Все дело в механизме действия системы CRISPR. Бактериофаги впрыскивают в клетку бактерии свою ДНК, которая многократно копируется и упаковывается в белковую оболочку за счет «хозяина» – ​таким образом на свет появляются новые бактериофаги. Защитная система бактерии, включающая белок-«ножницы» Cas, распознает чужую ДНК в случае, если она уже встречалась с ней раньше, и разрезает ее. Захватчики побеждены.

Узнавание мишени происходит по знаменитому принципу комплементарности, по которому образуются пары нуклеотидов в двуспиральной структуре ДНК. Этот принцип работает во всех живых организмах на нашей планете, включая клетки человека. Поэтому главное в механизме CRISPR/Cas – ​его простота и универсальность.

Знаковое событие случилось в 2012 г., когда была опубликована совместная работа француженки Э. Шарпентье и американки Д. Дудна, где было показано, что бактериальная система CRISPR/Cas может быть использована для внесения разрывов в последовательность любой ДНК, что свидетельствовало об ее огромном потенциале для редактирования геномов (Jinek et al., 2012). Ведь, зная нуклеотидную последовательность, можно внести разрыв в точно выбранное место любой ДНК.

Так в руках ученых оказался простой и эффективный инструмент, позволяющий направленно вносить изменения в ДНК живой клетки, т. е. переписывать те самые «скрижали». С тех пор вышли сотни научных статей, свидетельствующих о том, что эта система работает в самых различных видах организмов, позволяет вносить разрывы в любые последовательности генов, в том числе несущие мутации, вызывающие наследственные болезни (Немудрый, 2014).

Ремонтируем ДНК направленно

Но вот ДНК разрезана – ​что дальше? Дальше идет «ремонт» (репарация). Вообще разрывы в ДНК не такая уж и редкость: ежесуточно в каждой клетке человека под действием активных форм кислорода их возникает около 10 тысяч, и клетка их тщательно «штопает», восстанавливая целостность ДНК (Helbock et al., 1998). Но эти разрывы случайны, в отличие от действия CRISPR/Cas.

Существуют «терапевтические» мутации, предотвращающие развитие заболеваний. Например, мутации в гене CCR 5 предотвращают заражение клеток ВИЧ (Genovese et al., 2014, Liu et al., 1996), а мутация A673T в гене APP – ​развитие болезни Альцгеймера (Jonsson et al., 2012). С помощью системы CRISPR/Cas можно внести в геном необходимые изменения, «сломав» целевые гены либо внеся целевые замены (Cox et al., 2015)

Направленные разрывы, внесенные CRISPR/Cas, могут быть репарированы по-разному: существует несколько способов, отличающихся механизмом, точностью и т. п. В зависимости от пути репарации можно получить следующие результаты. Во-первых, «сломать» ген, если при репарации ДНК произойдет мутация. Такого эффекта можно добиться, если репарация произойдет, например, по механизму соединения негомологичных концов, для которого характерна неточность. Также возможно добиться крупной делеции (утраты фрагмента ДНК) и удалить участок либо целый ген.

Во-вторых, можно «переписать» определенную последовательность ДНК в клетке. Как известно, при репарации разрывов по пути гомологичной рекомбинации восстановление поврежденного участка ДНК идет по шаблону сестринской хромосомы (в клетках у нас присутствует по две копии каждой хромосомы – ​от отца и от матери). Фокус в том, что клетку можно обмануть, «подсунув» ей вместо сестринской хромосомы искусственно созданную «донорную» ДНК. Если такая ДНК будет «похожа» на поврежденный участок, то клетка может использовать ее в качестве образца.

Сестринская хромосома присутствует в клетке в единичном экземпляре, а копий «донорной» ДНК можно доставить множество, что дает искусственной ДНК конкурентное преимущество, пусть она и отличается немного от поврежденного участка. Таким образом можно «исправить», к примеру, мутацию, или вставить небольшой новый фрагмент ДНК.

И вот здесь мы вплотную подходим к терапии генетических заболеваний. Начнем с того, что все такие патологии отличаются друг от друга: они вызваны мутациями в разных генах, да и сами мутации могут иметь различную природу и давать разный эффект в одном и том же гене. Соответственно, есть разные варианты применения геномного редактирования: ген можно «сломать» или просто удалить мутантный участок, «исправить» мутацию или, напротив, добавить в геном полезные «терапевтические» мутации или даже новый дополнительный трансген.

В теории все это выглядит прекрасно, но вот в чем вопрос: в организме взрослого человека имеются десятки триллионов клеток, и в каждой из них содержится мутантный ген. Как эти подходы применить на практике? Как лечить реального пациента?

Работаем «в пробирке» и в организме

На самом деле в большинстве случаев нет нужды исправлять мутацию в каждой клетке организма. Например, серповидноклеточная анемия вызвана мутациями в гене, кодирующем субъединицу гемоглобина, что приводит к дисфункции только клеток крови – ​эритроцитов. А наследственные нейродегенеративные заболевания, например боковой амиотрофический склероз, связаны с гибелью нейронов определенных типов. Таким образом, мишенями для терапии многих генетических заболеваний могут быть клетки лишь определенных органов или тканей, где специфично синтезируются/не синтезируются продукты мутантных генов.

Суть редактирования геномов ex vivo («вне живого») заключается во введении в организм «здоровых» клеток, в которых, к примеру, будет синтезироваться нужный белок. Но если вводить клетки, взятые даже от здорового донора, то организм пациента с большой вероятностью их отторгнет. Поэтому нужно взять клетки самого пациента и изменить в них мутантный ген, а потом ввести их обратно. Наиболее разработан этот подход для заболеваний крови, поскольку забор и пересадка костного мозга, где идет кроветворение, практикуется с 1959 г.

Но что делать в случае, если «дефектные» клетки не так просто получить? Например, если болезнь проявляется в головном мозге? Вдобавок не все типы клеток способны пережить все процедуры в чашке Петри вне организма. Здесь на помощь приходит другая крайне перспективная технология нашего времени, связанная с получением так называемых индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК).

Плюрипотентные стволовые клетки бессмертны: теоретически они могут делиться бесконечно и при действии определенных стимулов образовывать любые клетки тканей и органов взрослого организма. Используя необходимый набор стимулов, можно направить развитие стволовых клеток в определенный тип клеток, например, в нейроны. Этот процесс называют направленной дифференцировкой

Относительно простой и эффективный способ получения стволовых клеток из клеток кожи в результате репрограммирования был изобретен в 2006 г. японскими исследователями К. Такахаси и С. Яманака (Takahashi & Yamanaka, 2006). Таким образом, появился метод вернуть практически любую клетку организма (крови, кожи, жировой ткани и т. д.) в состояние стволовой.

Возможность использования ИПСК для клеточной терапии наследственных заболеваний была впервые продемонстрирована на модели серповидноклеточной анемии (Hanna et al., 2007). В геном лабораторных мышей были встроены мутантные гены человека, приводящие к развитию этой болезни.

Из клеток кожи этих животных были получены индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, в которых мутация была исправлена с помощью гомологичной рекомбинации. Путем направленной дифференцировки из этих клеток были получены стволовые предшественницы клеток крови, которые трансплантировали в организм животных. Последние не только прижились, но и превратились в здоровые эритроциты. Лечение оказалось успешным.

С тех пор cписок наследственных болезней, для которых успешно был опробован этот подход, пополнился десятками наименований и продолжает расти.

Но зачем тратить время и деньги на извлечение и культивирование клеток, если можно все сделать прямо «на месте»? Ведь система CRISR/Cas в силу своей универсальности теоретически способна работать непосредственно в клетках живого организма. Главная проблема – ​это эффективно и безопасно доставить элементы этой системы в нужное место.

Сегодня наиболее часто для доставки генов CRISPR/Cas в организм используются вирусные частицы. В качестве таких носителей обычно выступают аденоассоциированные вирусы – ​дефектные вирусы, способные размножаться только в присутствии «помощников»-аденовирусов. Эти вирусы эффективно заражают клетки человека, но не вызывают у него никаких патологий. А вирусные частицы, в геном которых встроены гены CRISPR/Сas, после заражения уже не могут размножаться. При этом разные серотипы этих вирусов имеют «склонность» к разным тканям. Например, серотип AAV8 предпочитает ткани печени, а уже сегодня можно создать искусственные серотипы, нацеленные на любой орган.

Активно развиваются и невирусные способы доставки, например, упаковка готовых молекулярных комплексов РНК-белок в липосомы (липидные пузырьки) или полимерные частицы. Это более безопасно, а также обеспечивает более строгий контроль над дозой.

Это все здорово, но…

Всегда есть это «но». Технология CRISPR/Cas начала применяться для редактирования геномов млекопитающих пять лет назад. На сегодня получено колоссальное количество данных, достигнут огромный прогресс на пути к клиническому применению, но все же остается ряд вопросов, которые необходимо будет решить для каждого конкретного генетического заболевания. Например, какая доставка будет оптимальна? Приживутся ли введенные клетки? Какова будет эффективность и безопасность лечения? И etc. …

Возьмем для примера пару вопросов из этого списка и посмотрим, какие конкретные ответы на них уже получены в научном сообществе. Одна из проблем использования CRISPR/Cas связана с возможностью нецелевых эффектов: система может вносить разрывы в участки, отличающиеся от целевого на несколько «букв» – ​нуклеотидов, что чревато риском возникновения нежданных мутаций. Особенно остро вопрос безопасности стоит при редактировании геномов in vivo, когда проверить результат предварительно невозможно.

Для решения этой проблемы лидирующие группы ученых под руководством Д. Дудны, Ф. Чжана и К. Джуна независимо друг от друга создали мутантные «улучшенные» варианты белка Cas9 с повышенной специфичностью, частота нецелевых эффектов которых упала на несколько порядков.

С помощью технологии геномного редактирования можно не только лечить наследственные заболевания, но и создавать «дизайнерских» детей. Ведь если можно исправить ген, вызывающий болезнь, то почему бы не изменить ген, регулирующий цвет глаз, продолжительность жизни, наконец, интеллект? Уже сегодня в Китае с помощью CRISPR/Cas выведены собаки породы бигль, у которых «выключен» ген, кодирующий миостатин – фактор, подавляющий рост мышечной ткани. В результате эти животные отличаются повышенной мускулистостью. А что мешает «выключить» этот ген в эмбрионе человека?

Что касается эффективности терапии, то все зависит от особенностей самого заболевания и мутации, его вызывающей. Возможны три варианта: после исправления мутации жизнеспособность клеток увеличится, не изменится или ухудшится. В первом случае исправленные клетки получают конкурентное преимущество и могут постепенно заместить мутантные. Например, на линии мышей с наследственным заболеванием печени – ​тирозинемией I типа – ​было показано, что при системной доставке CRISPR/Cas непосредственно в организм животного мутация «исправляется» в 6 % клеток печени. Даже такого небольшого количества клеток достаточно, чтобы предотвратить падение веса и привести в норму биохимические показатели печени животных. А более жизнеспособные клетки с исправленной мутацией начинают «обживать» печень.

Но, к примеру, в случае гемофилии B жизнеспособность клеток после исправления мутации не повышается. Тем не менее уже 3—7 % клеток печени, продуцирующих нормальный фактор свертывания крови, достаточно для устойчивого терапевтического эффекта (Ohmori et al., 2017).

Что же касается исправления мутаций в онкогенах, то жизнеспособность и скорость пролиферации таких клеток будет снижаться относительно раковых, поэтому эффективность подобной терапии вызывает сомнения.

Тем не менее пример гемофилии B показывает, что если заболевание связано с отсутствием какого-то фермента или гормона, то небольшого числа клеток, его продуцирующих, может хватить, по крайней мере, для перевода болезни в более мягкую форму, а в некоторых случаях и для полного восстановления утраченных функций.

Классическими же модельными заболеваниями в исследованиях по терапии с помощью геномного редактирования являются гемоглобинопатии и мышечная дистрофия Дюшенна. Именно на этих заболеваниях была подтверждена работоспособность концепций такого лечения, показано, что клетки с исправленной мутацией демонстрируют «здоровый» фенотип. В случае мышечной дистрофии Дюшенна такие клетки не только успешно встраивались в мышечную ткань взрослых мышей, но и улучшали функциональные показатели всей мышцы в целом.

Система CRISPR/Cas9 открывает перед человечеством большие перспективы, но нужно понимать, что это не волшебная палочка для решения всех проблем, а инструмент, такой, как, например, молоток. И нужно учиться применять этот инструмент для каждой конкретной задачи.

Главный шаг, который уже был сделан в этой области, – ​это выход за пределы лабораторий. Уже существует ряд компаний, занимающихся внедрением технологии CRISPR/Cas в практику, и не только медицинскую. Этот подход, к примеру, используется сегодня для получения модифицированных микробов для нужд биотехнологии и модифицированных растений.

Можно ожидать, что уже в ближайшее десятилетие новая технология найдет и клиническое применение. Так, в 2016 г. в Китае стартовали первые клинические испытания нового метода иммунотерапии метастазирующего немелкоклеточного рака легкого, в котором используются T-лимфоциты с «отредактированным» геномом.

С. М. ЗАКИЯН: «НАМ БЫЛ БРОШЕН ВЫЗОВ, И МЫ ДОЛЖНЫ НА НЕГО ОТВЕТИТЬ!» Исследования по применению системы CRISPR/Cas для терапии наследственных заболеваний начались в лаборатории эпигенетики развития ИЦиГ СО РАН под руководством С. М. Закияна в 2013 г., буквально сразу после выхода первых публикаций на эту тему.

Исследования ведутся на лабораторных крысах линии Brattleboro – ​модели генетически детерминированного заболевания, при котором наблюдается дефицит гормона аргинин-вазопрессина. В результате у животных развивается наследственный несахарный диабет с характерным для него чрезмерным потреблением жидкости. На сегодня уже получена линия клеток с исправленной мутацией в гене, кодирующем этот гормон.

В данном случае задача усложнялась тем, что ген вазопрессина по последовательности нуклеотидов схож с геном другого гормона – ​окситоцина. Более того, на участке, в котором возникла мутация у крыс Brattleboro, эти гены практически идентичны. Тем не менее удалось добиться специфичного действия CRISPR/Cas в гене вазопрессина без нецелевых двунитевых разрывов ДНК в гене окситоцина. На следующем этапе предполагается вводить исправленные клетки в организм животных для оценки терапевтического эффекта

Возможности, которые дает нам технология CRISPR/Cas, пугающие и захватывающие одновременно. Сначала китайские исследователи, а затем их коллеги из США смогли внести изменения в эмбрионы человека. Недавно группа американских ученых под руководством Ш. Миталипова «исправила» в человеческом эмбрионе мутацию, вызывающую гипертрофическую кардиомиопатию (Ma et al., 2017). Эти эмбрионы были получены специально в результате искусственного оплодотворения, для которого были использованы здоровая яйцеклетка и сперматозоиды носителя мутации. Согласно современным нормам, зародыши были выведены из эксперимента на стадии бластоцисты. Однако с помощью современных репродуктивных технологий уже сегодня можно было бы имплантировать такие эмбрионы суррогатным матерям.

И здесь возникает очень серьезный этический вопрос: имеем ли мы право вмешиваться в ДНК человека? Или, наоборот, этично ли бездействовать, обрекая будущего ребенка на страдания?

Генетические изменения, внесенные в эмбрионы, сохранятся во всех клетках взрослого организма, и, соответственно, будут передаваться по наследству. Какой эффект окажет распространение таких модифицированных генов на человеческую популяцию в эволюционном аспекте, не говоря уже о риске возникновения новых евгенических движений?

Именно поэтому Д. Дудна, имеющая колоссальный авторитет в научном мире, призывает своих коллег не торопиться с применением этой технологии на эмбрионах человека, пока не будут разработаны международные этические и законодательные нормы для ее регулирования. В наши дни по всему миру проходят встречи, конференции, конгрессы и симпозиумы, на которых обсуждается будущее CRISPR/Cas. Возможно, от решений, которые будут приняты на них сейчас, зависят судьба человечества и то, как будет выглядеть наш мир в будущем.

В сентябре 2018 г. в новосибирском Академгородке также планируется провести международный конгресс по современным технологиям редактирования геномов, на котором будет обсуждаться технология CRISPR/Cas и, в частности, ее будущее в Российской Федерации.

Литература

Немудрый А. А., Валетдинова К. Р., Медведев С. П. и др. Системы редактирования геномов TALEN и CRISPR/Cas – инструменты открытий // Acta Naturae. 2014. Т. 6. № 3(22). С. 20—42.

Cox D. B., Platt R. J., Zhang F. Therapeutic genome editing: prospects and challenges // Nat Med. 2015. V. 21. N. 2. P. 121—131.

Jinek M., Chylinski K., Fonfara I. et al. A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity // Science. 2012. V. 337. N. 6096. P. 816—821.

Ma H., Marti-Gutierrez N., Park S. W. et al. Correction of a pathogenic gene mutation in human embryos // Nature. 2017. V. 548. N. 7668. P. 413—419.

https://ria.ru/20200316/1568576203.html

Ворота для инфекции. Встроится ли новый коронавирус в ДНК человека

Ворота для инфекции. Встроится ли новый коронавирус в ДНК человека — РИА Новости, 16.03.2020

Ворота для инфекции. Встроится ли новый коронавирус в ДНК человека

Почти восемь процентов ДНК человека приходится на фрагменты древних вирусов. Одни привели к полезным мутациям, повлиявшим на эволюцию, другие — к болезням… РИА Новости, 16.03.2020

2020-03-16T08:00

2020-03-16T08:00

2020-03-16T09:30

наука

московский физико-технический институт

открытия — риа наука

здоровье

биология

днк

геном

эволюция

https://cdnn21.img.ria.ru/images/07e4/03/10/1568650541_0:222:2982:1899_1920x0_80_0_0_a515a7b8b73770a352735a903ef93933.jpg

МОСКВА, 16 мар — РИА Новости, Альфия Еникеева. Почти восемь процентов ДНК человека приходится на фрагменты древних вирусов. Одни привели к полезным мутациям, повлиявшим на эволюцию, другие — к болезням. Изучая эти вирусные элементы, генетики доказали, что люди в прошлом не раз благополучно переживали опасные пандемии. Чем грозит нашему геному новый коронавирус — в материале РИА Новости. Засоренный геномВ человеческом геноме содержится около 98 тысяч эндогенных ретровирусных элементов (ЭРВ) — последовательностей ДНК древних вирусов, которыми когда-то заражались наши предки. По разным данным, ЭРВ объединяются в 30-50 семейств, которые, в свою очередь, подразделяются почти на двести групп и подгрупп. И лишь менее одного процента ЭРВ встречается только у человека. То есть они встроились в геном уже после того, как ветви людей и шимпанзе разделились. По подсчетам, последний ретровирус, сумевший стать частью нашей ДНК, инфицировал человеческую популяцию около 150 тысяч лет назад. Судя по его первоначальному геному, который удалось восстановить сразу двум группам ученых, это был крайне заразный экзогенный ретровирус. Иными словами, сотни тысяч лет назад наши предки пережили настоящую пандемию. «В геном интегрировались только те вирусы, которые обладали механизмом обратной транскрипции, то есть умели из РНК делать ДНК. Поэтому их еще называют ретровирусами. Когда такая частица проникала в клетку, превращала РНК в ДНК, а затем встраивала его в геном и оставалась там, как сейчас выясняется, на века. Но тут есть нюанс. Эти древние вирусы могли инфицировать либо половые клетки, либо герминальные — из них на ранних стадиях эмбриогенеза образуются сперматозоиды и яйцеклетки. И это на самом деле нетривиальная задача, потому что большинству вирусных частиц половые клетки неинтересны. Их слишком мало. Зато, попав в них, вирус размножается как горизонтально, так и вертикально — передаваясь потомкам хозяина. Но это бывает крайне редко», — объясняет РИА Новости заведующий лабораторией геномной инженерии МФТИ, вирусолог Павел Волчков.Вирусная помощьВ 2014 году британские исследователи подсчитали, что за последние десять миллионов лет в геномах 38 видов животных осело больше 27 тысяч эндогенных ретровирусных элементов. Причем чем крупнее был организм, тем меньше ЭРВ встречалось в его ДНК. Так, если у мыши обнаружили почти три с половиной тысячи вирусных вставок, то у человека — чуть больше тысячи, а у синего кита — и вовсе только 55. Авторы работы предположили, что обилие этих вирусных участков в геноме потенциально опасно: они могут быть связаны с мутациями, в результате которых развиваются злокачественные опухоли. А чем крупнее животное, тем реже болеет раком. Однако уже через год международная группа ученых доказала, ЭРВ — не вредный генетический мусор. Они играют важную роль в процессе развития эмбриона у приматов, а значит, и человека. Выяснилось, что у молекул РНК, транскрибируемых из межгенных участков ДНК, вирусная природа. И их блокировка полностью останавливает рост зародыша. Следы эволюцииВ начале нулевых расшифровали нуклеотидные последовательности ДНК многих видов животных. Оказалось, что все эндогенные вирусы расположены в строго определенных местах. Некоторые ЭРВ встречались лишь у человека или кошки, другие же были общими сразу для нескольких видов — скажем, человека, шимпанзе, гориллы и орангутана.»Прослеживая интеграцию этих ретровирусов в нашу ДНК, можно понять, когда именно разошлись те или иные ветви эволюционно. Потому что встраивание вируса — это событие с конкретной датой, когда какой-то наш общий предок был инфицирован. Вирус встроился в его геном, и теперь этот кусок ДНК есть у всех на планете. Понятно, что таких случаев в процессе эволюции у нас было много. И одинаковое расположение одних и тех же вирусных вставок в геномах двух или более животных говорит о том, что они произошли от одного предка», — говорит Павел Волчков. По его словам, хотя в геноме эти вирусы, как правило, неактивны, они могут провоцировать новые мутации, в том числе и полезные. «При делении клеток ДНК постоянно повреждается. Для починки используются точно такие же области другой, сестринской хромосомы. Но из-за огромного количества повторяющихся эндогенных ретровирусов, интегрированных в наш геном, репарационный механизм может «перепутать» место. В результате происходит либо транслокация (перестройка), либо инверсия, которые способны привести к мутации. Для отдельного индивидуума это играет нейтральную либо негативную роль. Но для видообразования это крайне важный процесс, поскольку так возникают новые гены», — отмечает ученый. Согласно работе датских исследователей, подобным образом появились гены ENVV1 и ENVV2, управляющие слиянием клеток в процессе формирования наружного слоя плаценты. Также они защищают эмбрион от иммунной системы матери. По подсчетам биологов, эти гены остались от древних вирусов, инфицировавших нашего далекого предка 50-70 миллионов лет назад. Российские ученые предполагают, что ЭРВ сыграли решающую роль в развитии умственных способностей Homo sapiens. Так, один из вирусных элементов, встречающийся только в человеческой ДНК, расположен около гена PRODH и, судя по всему, усиливает его активность. Этот ген кодирует фермент, связанный с синтезом одного из нейромедиаторов, который стимулирует передачу сигналов возбуждения в нервной системе. У наших ближайших родственников, шимпанзе, тоже есть PRODH, но нет ЭРВ, и этот ген у них менее активен.Когда вирус внедряется в ДНКНесмотря на значительное количество ЭРВ в геномах животных, вирусы довольно редко могут встроиться в ДНК половых клеток и закрепиться в ней навсегда, считают специалисты. Поэтому вероятность того, что патогены, циркулирующие сегодня в человеческой популяции, — вирус Эбола, Зика или новый коронавирус — встроятся в геном, крайне мала. Даже наиболее подходящий на эту роль ВИЧ, относящийся к семейству ретровирусов, не способен поражать половые клетки. «Встроиться в геном может только ретровирус, имеющий ДНК-стадию. Правда, есть маленькое исключение: когда клетка одновременно заражается двумя инфекционными частицами, одна из которых относится к семейству ретровирусов. Но это достаточно случайное событие. Его нельзя отрицать, потому что следы таких событий у нас в геноме есть. Однако его вероятность близка к нулю», — пояснил Павел Волчков.

https://ria.ru/20160323/1395536650.html

https://ria.ru/20131119/977997043.html

https://ria.ru/20170110/1485396612.html

2020

Новости

ru-RU

https://ria.ru/docs/about/copyright.html

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/

https://cdnn21.img.ria.ru/images/07e4/03/10/1568650541_0:0:2732:2048_1920x0_80_0_0_b77642cbac368da5c2a590960852934f.jpg

московский физико-технический институт, открытия — риа наука, здоровье, биология, днк, геном, эволюция, генетика