Механизм репарации ошибочно спаренных оснований на примере e coli

Система
коррекции редко встречающихся
несоответствий спаривания оснований
остающихся после репликации ДНК E.
coli
«увеличивает общую точность» копирования
данной информационной молекулы на
величину, равную 10²
– 10³.
При этом, учитывая, что в результате
репликации в дочерних двухцепочечных
ДНК могут появляться неканонические
пары оснований, данная система репарации
должна уметь отличать присутствие
«правильного» основания в материнской
цепи от неканонического «неправильного»
таутомерного основания в новосинтезированной
дочерней цепи. Для этого клетка использует
особый принцип мечения исходной
материнской цепи путем ее метилирования
по отдельным основаниям. Система
репарации ошибочного спаривания
оснований у E.
coli
состоит, по крайней мере, из 12 различных
белков, которые включаются как в процесс
распознавания матричной цепи, так и в
процесс самой репарации.

Механизм
распознавания матричной и новосинтезированной
цепей ДНК не известен у большинства
бактерий и, тем более, у эукариот, однако,
достаточно неплохо охарактеризован у
E.
coli
и некоторых
родственных ей микроорганизмов. Так, у
E.
coli
в процессе распознавания цепей в дочерней
ДНК принимает участие, уже известная,
Dam-метилаза,
которая метилирует остатки аденина по
N⁶-положению
во всех последовательностях (5^/)GATC.
Cразу
после прохождения репликативной вилки
имеется малый промежуток времени (от
нескольких секунд до нескольких минут)
в течение которого последовательности
(5^/)GATC
в исходных материнских цепях метилированы,
в то время как в дочерних цепях
метилирование отсутствует. Преходящее
неметилированное состояние
последовательностей GATC
в новосинтезированных цепях дает
возможность клетке отличать их от
материнских цепей в реплицированной
молекуле ДНК. Затем ошибки репликации
присутствующие поблизости от
полуметилированного сайта GATC
репарируются только в новосинтезированных
цепях на основании того, что в родительской
цепи указанная последовательность
метилирована. Дополнительные эксперименты,
проведенные in
vitro,
показали, что при наличии метилированных
последовательностей GATC
в обеих цепях реплицированной ДНК
система коррекции несоответствий
спаривания может исправить лишь
незначительное количество таких ошибок.
При отсутствии метилирования
последовательностей GATC
в обеих цепях процесс репарации
осуществляется, но указанная система
коррекции не отдавая предпочтения ни
одной из двух цепей, сама делает при
этом в половине случаев ошибки.

Клеточная
система репарации несоответствий
спаривания, функционирование которой
зависит от степени метилирования ДНК,
может исправлять указанные повреждения
даже расположенные на расстоянии до
1.000 пар оснований от полуметилированной
последовательности GATC.

Каким
же образом процесс коррекции «плохой
подгонки пар оснований» направляется
последовательностями GATC,
расположенными на достаточно большом
расстоянии? Механизм данного процесса
иллюстрирует схема, приведенная на рис.
2.

Как
следует из рисунка, белок MutL
образует комплекс с другим белком –
MutS и данный двойной
комплекс связывается со всеми неправильно
спаренными основаниями (кроме пар С-С).
В свою очередь, белок MutH
взаимодействует с белком MutL
и последовательностями GATC,
на которые наталкивается комплекс
MutL-MutS.
Участки ДНК расположенные по обе стороны
от обнаруженного повреждения
«протягиваются» через комплекс MutL-MutS
образуя петлю. В целом, синхронное
продвижение через указанный комплекс
белков участков ДНК прилегающих к
образованной петле равносильно
одновременному движению таких комплексов
вдоль ДНК в противоположных направлениях.
Характерная особенность белка MutH
состоит в том, что он обладает
сайт-специфической эндонуклеазной
активностью, которая проявляется только
тогда, когда весь тройной комплекс
наталкивается на полуметилированный
сайт GATC. В этом сайте MutH
катализирует эндонуклеолитическое
расщепление неметилированной цепи ДНК
с 5^/-стороны гуанинового нуклеотида
(G) последовательности
GATC, которая метит цепь,
подлежащую исправлению. Дальнейшие
этапы репарации зависят от местоположения
неправильно спаренных оснований
относительно сайта расщепления (рис.
3).

Если
неправильно спаренное основание
находится на 5^/-стороне сайта
расщепления, неметилированная цепь ДНК
выплетается из двойной спирали и
разрушается в направлении 3^/5^/
от сайта расщепления, проходя через
поврежденное основание. Утраченный
сегмент ДНК замещается новым участком.
Описанный процесс зависит от согласованного
действия многих ферментов и вспомогательных
белков: ДНК-геликазы II,
SSB-белков, экзонуклеазы
I или экзонуклеазы Х (оба
фермента расщепляют цепи ДНК в направлении
3^/5^/),
ДНК-полимеразы III и
ДНК-лигазы. Способ репарации неправильно
спаренного основания расположенного
на 3^/-стороне сайта расщепления
напоминает описанный выше процесс за
исключением необходимости участия
другого набора экзонуклеаз. В этом
случае поврежденный участок ДНК удаляется
с помощью экзонуклеазы VII
(способной деградировать одноцепочечную
ДНК как в направлении 3^/5^/,
так и в направлении 5^/3^/)
или нуклеазы RecJ (деградирующей
одноцепочечную ДНК в направлении 5^/3^/).

Репарация
неправильно спаренных оснований является
весьма дорогостоящим процессом для
клеток E. coli
в смысле энергетических затрат. Как
указывалось выше, неправильно спаренное
основание может находиться на расстоянии
в 1.000 или даже более пар оснований от
последовательности GATC.
Деградация и последующая замена
одноцепочечного участка ДНК такой длины
требует огромного расходования
активированных предшественников
дезоксирибонуклеотидов для репарации
всего одного единственного неправильно
спаренного основания. Приведенные
рассуждения еще раз подчеркивают
чрезвычайную важность сохранения
целостности генома в клетке.

Системы
коррекции несоответствий спаривания
оснований остающихся после репликации
ДНК также функционируют в клетках
эукариотических организмов. При этом
во всех эукариотических клетках
обнаруживаются особые белки структурно
и функционально аналогичные бактериальным
белкам MutS и MutL
(но не белку MutН). Мутации
в генах человека, кодирующих белки
аналогичного типа, служат причиной
врожденной предрасположенности к
развитию ряда общеизвестных злокачественных
новообразований, еще раз подчеркивая
огромное значение систем репарации ДНК
для любого организма. Основными гомологами
бактериального белка MutS
у большинства эукариот, от дрожжей до
человека, являются MSH2
(MutS
homolog
2), MSH3 и MSH6.
В ходе репарации гетеродимеры белков
MSH2 и MSH6, как
правило, связываются с одним единственным
неправильно спаренным основанием или,
менее прочно и реже с несколько более
протяженным участком ДНК, содержащим
петлю, образование которой обусловлено
присутствием нескольких неправильно
спаренных оснований. В основном же более
протяженные участки поврежденной ДНК,
включающие от 2 до 6 неправильно спаренных
оснований, узнаются гетеродимерами
белков MSH2 и MSH3,
или узнаются как димерами MSH2-MSH3,
так и димерами MSH2-MSH6.
При этом комплексы MSH
стабилизируются путем связывания
гомолога бактериального белка MutL,
который представлен, главным образом,
в виде гетеродимера, состоящего из белка
MLH1 и белка PMS1
(название которого происходит от
post—meiotic
segregation).
Более тонкие детали функционирования
системы коррекции неправильно спаренных
оснований у эукариот по-прежнему остаются
предметом исследования. В частности,
до сих пор неизвестно каким образом
данная система репарации отличает
дочернюю цепь ДНК от материнской, хотя
уже установлено, что идентификация
новосинтезированной цепи ДНК у эукариот
не связана с последовательностью GATC.

Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]

• #
• #
• #
• #
• #
• #
• #
• #
• #
• #
• #

Эксцизионная репарация нуклеотидов: введение
ЭР — эксцизионная репарация ДНК; ЭР-комплекс включает ПАРП , XRCC1 , ДНК-лигазу III и ДНК-полимеразу бета .
Два пути осуществления NER:
1. Гидролиз фосфодиэфирной связи по 3′- или 5′- концу на некотором расстоянии от ошибочно спаренного (поврежденного) нуклеотида, который далее целиком удаляется под действием 5′->3′- (или 3′->5′-) экзонуклеазы, гидролизующей
цепь ДНК нуклеотид за нуклеотидом в соответствующем направлении от первоначального одноцепочечного разрыва в репарируемой ДНК. Образующаяся брешь далее заполняется ДНК-полимеразой. Такой механизм репарации реализуется у E. coli и человека для вырезания неповрежденных (немодифицированных) ошибочно спаренных нуклеотидов. Механизм последовательного эндо- и экзонуклеазного расщепления ДНК не используется для удаления поврежденных (измененных) нуклеотидов. Это связано с тем, что такие нуклеотиды часто являются ингибиторами экзонуклеаз.
2. Функционирует у всех исследованных видов организмов и заключается в использовании ферментной системы, которая вносит одноцепочечные разрывы по обе стороны от поврежденного нуклеотида на некотором расстоянии от него с последующим удалением одноцепочечного фрагмента ДНК, содержащего измененный нуклеотид.
Гидролизуется 3-5-фосфодиэфирную связь с 3′-конца от повреждения. При этом прокариоты гидролизуют также 8-связь от 5′-конца
измененного нуклеотида, тогда как у эукариотических организмов происходит одноцепочечный разрыв на расстоянии 21-25 нуклеотидов от повреждения со стороны его 5′-конца. Таким образом, прокариоты удаляют измененный нуклеотид в составе 12-13-членных олигомеров, тогда как эукариоты — в составе одноцепочечных фрагментов ДНК длиной в 27-29 нуклеотидов. Ферментная система, вносящая такие двойные одноцепочечные разрывы, получила название эксцизионной нуклеазы (эксцинуклеазы) . Образующаяся в молекуле репарируемой ДНК одноцепочечная брешь далее заполняется с помощью ДНК-полимеразы, а фосфодиэфирная связь в остающемся одноцепочечном разрыве восстанавливается ДНК-лигазой.
В отличие от ЭРО и прямых реверсий, которые специфичны к достаточно узкому кругу повреждений ДНК, система ЭРН, хотя и с разной эффективностью, удаляет все возможные повреждения, и потому роль ее в поддержании стабильности генома велика. ЭРН детально изучена у E. coli и активно изучается в клетках
дрожжей и человека, причем в последних благодаря раскрытию генетической природы таких заболеваний, как пигментная ксеродерма ( ХР ), синдром Кокейна ( СS ) и заболевания трихотиодистрофия ( ТТD)
В ЭРН задействовано 6-8 генов у E. coli и до 30 у человека.
Если повреждение в транскрибируемой (матричной) нити ДНК задерживает продвижение РНК-полимеразы, то специальный белковый фактор TRCF ( transcription-repair coupling factor ) сталкивает РНК-полимеразу и связывает с этим местом комплекс ферментов репарации. См. Сопряжение транскрипции и репарации ДНК у E/coli.
Ферментный ансамбль осуществляющий первые 3 стадии процесса NER называется эксцинуклеазой.
В системе эксцизионной репарации ДНК путем удаления нуклеотидов поврежденные азотистые основания вырезаются в составе олигонуклеотидов.
NER: регуляция
Для клеток животных не характерен SOS-ответ, свойственный клеткам E. coli и представляющий собой суммарную реакцию бактериальной клетки на повреждение ДНК различными агентами,
проявляющийся в усилении транскрипции генов NER. Посттрансляционные модификации белков репарации, происходящие в ответ на повреждение ДНК, не влияют на активность эксцинуклеазы человека.
Обнаружено, что повреждения ДНК стабилизирует белок р53- белок-супрессор опухолевого роста, являющийся регулятором транскрипции. Имеются данные о том, что белок р53 может взаимодействовать с белками XPB и RPA, необходимыми для NER. Однако клетки с инактивированными генами р53 (p53(-/-)), как и клетки дикого типа, эффективно удаляют из поврежденной ДНК два основных фотопродукта, возникающих под действием УФ-света, и обладают такой же устойчивостью к УФ. Поэтому считается, что белок р53 не оказывает прямого влияния на NER. Белки Cdk7 и циклин H, которые образуют Cdk-активирующую киназу, входят в состав комплекса TFIIH, что позволяет предполагать наличие связи репарации ДНК с фазами клеточного цикла.
ЭРН (NER): сопряжение с транскрипцией (ТЭРН)
Транскрибируемые последовательности нуклеотидов ДНК, особенно
в матричной цепи, репарируются с большей скоростью, чем нетранскрибируемые последовательности. В клетках больных с синдромом Кокайна не наблюдается такой асимметрии в репарации.
В клетках E. coli белковый фактор, кодируемый геном mfd и сопрягающий транскрипцию и репарацию, замещает остановившиеся перед повреждением молекулы РНК-полимеразы, что приводит к диссоциации транскрипционного комплекса. При этом он привлекает экзонуклеазный репаративный комплекс к поврежденному участку ДНК. См. Сопряжение транскрипции и репарации ДНК (ТЭРН) у E/coli
В клетках животных ген CSB кодирует белок с молекулярной массой 160 кДа, который содержит хеликазный домен и, возможно, выполняет те же функции, что и белок Mfd у E. coli . На основе поведения клеток с мутантными генами белков CSA и CSB разработана модель механизма, с помощью которого обеспечивается асимметричная репарация цепей ДНК. В соответствии с этой моделью РНК-полимераза II , остановившаяся в процессе транскрипции
перед поврежденным участком ДНК, распознается комплексом CSA-CSB и перемещается в сторону от повреждения без разрушения четвертичной структуры транскрипционного комплекса. Одновременно комплекс CSA-CSB привлекает компоненты репаративной системы XPA и TFIIH к месту повреждения ДНК и помогает сборке эксцинуклеазного комплекса. Нуклеотиды поврежденной цепи вырезаются, и брешь репарируется. После этого РНК-полимераза в составе транскрипционного комплекса продолжает транскрипцию.
NER: механизм
Процесс NER можно разделить на четыре этапа: а) распознавание поврежденного участка ДНК; б) двойное надрезание (инцизия) цепи ДНК по обеим сторонам поврежденного участка и его удаление (эксцизия); в) заполнение бреши в процессе репаративного синтеза; г) лигирование оставшегося одноцепочечного разрыва ДНК.
NER человека распознает и удаляет одиночные ошибочно спаренные нуклеотиды, а также петли длиной в 1-3 нуклеотида. NER человека способна различать цепи ДНК в случае распознавания поврежденных
нуклеотидов. Показано, что при наличии в ДНК димеров тимина циклобутанового типа вырезание нуклеотидов происходит исключительно из поврежденной цепи. Механизм такого распознавания в настоящее время неизвестен, как и молекулярный механизм узнавания самих поврежденных оснований. Система способна распознавать повреждения как сильно, так и слабо деформирующие вторичную структуру ДНК. При этом не обнаружена линейная зависимость между коэффициентом специфичности нуклеазы (kcat/km) и уровнем деформации двойной спирали ДНК. Показано, что в процессе распознавания участвуют белковые комплексы XPA/RPA, которые преимущественно связываются с поврежденной ДНК, и TFIIH, обладающий АTP-зависимой ДНК-расплетающей активностью. Последний взаимодействует с поврежденным участком ДНК и по аналогии с соответствующим механизмом у E. coli локально раскручивает ДНК, создавая основной преинцизионный комплекс с поврежденной ДНК.
Установлено, что три фермента репарации, обладающие узкой
субстратной специфичностью: ДНК-фотолиаза (удаление пиримидиновых димеров), урацилгликозилаза (удаление урацила из ДНК) и экзонуклеаза III (гидролиз ДНК в AP-сайтах), втягивают поврежденный участок из двойной спирали в полость фермента, что приводит кофактор или аминокислотные остатки активного центра этих ферментов в непосредственный контакт с расщепляемыми связями ДНК. Не исключено, что система эксцинуклеазы действует таким же образом.
Основные этапы функционирования NER, следующие за распознаванием поврежденного участка ДНК, представлены на рис. I.59. После связывания комплекса XPA-RPA с измененным участком ДНК, XPA взаимодействует с комплексом TFIIH, который создает преинцизионный комплекс, что сопряжено с гидролизом ATP. ATP-зависимое расплетание ДНК комплексом TFIIH подготавливает ее к взаимодействию с двумя XP-белками, обладающими нуклеазной активностью. XPG связывается с TFIIH и вносит одноцепочечный разрыв с 3′-конца повреждения. Аналогично комплекс ERCC1-XPF
взаимодействует с XPA в составе преинцизионного комплекса и способствует одноцепочечному разрыву с 5′-конца повреждения. Образование обоих разрывов является ATP-зависимым, и их расположение на ДНК высокоспецифично. Как правило, происходят разрывы 5-й и 24-й фосфодиэфирных связей соответственно от 3′- и 5′-концов поврежденных участков. Однако расположение точек разрывов может варьироваться.
Таким образом, в результате подобных одноцепочечных надрезов ДНК может освобождаться фрагмент длиной 24-32 нуклеотида с преобладанием фрагментов длиной 27-29 нуклеотидов. На расположение сайтов одноцепочечных разрывов влияют характер повреждения и последовательности нуклеотидов (контекст), окружающих поврежденный участок. Ту же самую картину инцизии обнаруживают in vivo в ооцитах Xenopus и у Schizosaccharomyces pombe. На этом основании делают вывод об универсальном механизме эксцизионной репарации у эукариот.
Репаративный синтез ДНК у человека является PCNA-зависимым,
т.е. может осуществляться с участием ДНК-полимераз Polдельта и Polэпсилон. PCNA связывается с системой праймер-матрица под действием фактора репликации RFC, откуда следует, что последний также участвует в репаративном синтезе ДНК. В опытах с бесклеточными системами моноклональные антитела к Polдельта специфически подавляют репаративный синтез. Однако оказалось, что в тех же высокоочищенных бесклеточных системах вместо Polдельта с аналогичным эффектом могут быть использованы Polэпсилон и даже фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I E. coli. Это означает, что реконструированные из очищенных компонентов бесклеточные системы лишь в ограниченной степени имитируют биохимические процессы, происходящие в живых клетках. Считается, что обе ДНК-полимеразы — Polдельта и Polэпсилон участвуют в репаративном синтезе ДНК у человека.
ПАРП: модели управления процессом эксцизионной репарации ДНК
ПАРП — один из первых ядерных факторов, распознающих повреждение ДНК , и поэтому в идеальном случае управляет запуском механизма
репарации ДНК в живых клетках с места повреждения ДНК. Эта модель поддерживается идентификацией ЭР -комплекса, включающего ПАРП , XRCC1 , ДНК-лигазу III и ДНК-полимеразу бета . Присутствие ПАРП в таком мультипротеиновом комплексе доказывает, что этот фермент может направлять аппарат репарации ДНК к сайтам повреждения ДНК in vivo и облегчает осуществление репарации по этому пути.
XRCC1-белок действует как молекулярные «леса», формируя ЭР-комплекс путем индивидуального взаимодействия с каждым компонентом. С тех пор, как была обнаружена возможность поли(АДФ-рибозил)ирования XRCC1-белка in vitro, можно предположить, что ПАРП способен регулировать активность комплекса путем модифицирования XRCC1-белка in vivo и нарушать его способность взаимодействовать с другими компонентами комплекса. Было показано, что сверхэкспрессия XRCC1-белка подавляет активность ПАРП в живых клетках.
Аналогично ДНК-лигаза III ингибирует активность ПАРП in vitro, когда ее количества превышают количества ПАРП.

ПАРП может также рекрутировать факторы репарации ДНК путем модификации хроматиновых белков. Длинные цепи ПАР действительно способны направить ферменты репарации к сайтам разрывов ДНК значительно быстрее, нежели если они ищут повреждение сами по всему ядру. Такая модель согласуется с активностью ПАРП перед и/или после удаления поврежденных оснований.
NER: структура и функции белков
В табл. I.21 суммированы свойства белков животных, участвующих в NER. Большинство этих белков существует in vivo в виде комплексов, поэтому ферментативные активности, обнаруживаемые у отдельных белков в очищенном состоянии, могут не иметь прямого отношения к их функциям в системе NER.
XPA — белок с молекулярной массой 31 кДа, обладает доменом типа «цинковые пальцы», участвует в распознавании поврежденного участка ДНК, взаимодействует с другими компонентами системы и может функционировать в качестве фактора нуклеации для экзонуклеазы. XPA взаимодействует своим N-концевым доменом
с гетеродимером ERCC1-XPF, а С-концевым доменом — с TFIIH.
Белок RPA (HSSB) образует комплекс с XPA и усиливает его специфичность в отношении поврежденной ДНК. RPA (HSSB) — тример, состоящий из белковых субъединиц р70, р34 и р11, необходим для репликации ДНК и репаративного синтеза, а также для прохождения этапа двойного надреза ДНК во время эксцизионной репарации. Он обладает умеренным сродством к поврежденной ДНК.
TFIIH — олигомерный комплекс, в состав которого входят белки р89, р80, р62, р44, р41, р38 и р34. Этот белковый комплекс был открыт как один из семи основных факторов транскрипции, необходимых для эффективного функционирования РНК-полимеразы II . Субъединица р89 идентична белку репаративного комплекса XPB. Обнаружено отсутствие функциональной комплементации между бесклеточными экстрактами клеток с мутантными белками XPB и XPD, определяемой по восстановлению репарирующей активности в смешанных экстрактах. Комплекс TFIIH представляет собой
фактор репаративной системы. Белки XPB и XPD являются ДНК-зависимыми АТРазами, обладают хеликазными доменами и могут (как и сам фактор TFIIH) вызывать диссоциацию гибридов, образованных между короткими фрагментами ДНК и одноцепочечной ДНК.
XPC — белок с молекулярной массой около 125 кДа, существует в виде гетеродимера в комплексе с белком р58, который является гомологом белка Rad23 дрожжей (HHR23B). XPC слабо связывается с TFIIH и очень прочно — с одноцепочечной ДНК.
ERCC1/XPF — прочный белковый комплекс, с которым взаимодействует белок XPA, обладающий эндонуклеазной активностью, специфичной в отношении одноцепочечной ДНК.
XPG — белковый комплекс, обладающий эндонуклеазной активностью, специфичной в отношении одноцепочечной ДНК; вовлекается в эксцизионный комплекс посредством взаимодействия с TFIIH и RPA.
ЭРН (NER): генетика
Гены NER E. coli, uvrA, uvrB и uvrC не обнаруживают гомологии с соответствующими генами человека. Гены NER дрожжей и человека
высокогомологичны, и энзимология эксцизионной репарации также обладает большим сходством. По крайней мере, три заболевания у человека вызываются генетическими нарушениями системы эксцизионной репарации: пигментная ксеродерма, синдром Кокейна и трихотиодистрофия.
Кожа больных пигментной ксеродермой обладает повышенной чувствительностью к дневному свету, что проявляется в виде фотодерматозов, включая рак кожи. В ряде случаев отмечены аномалии нервной системы, причиной которых являются мутации в одном из семи генов: XPA, XPB, XPC, XPD, XPE, XPF, XPG. Однако описаны больные с классическими симптомами пигментной ксеродермы, но с ненарушенной системой NER. Для клеток этих больных характерны изменения в так называемой пострепликативной репарации .
Больным с синдромом Кокейна присущи нарушения роста, умственная отсталость, катаракты, повышенная чувствительность к свету с сопутствующими дерматозами. Обнаружены мутации в двух группах генов, приводящие к этому заболеванию. У больных
с мутантными генами CS-A или CS-B клетки способны нормально репарировать УФ-повреждения ДНК. У другой группы больных обнаружены мутации в генах XPB, XPD или XPG.
У больных трихотиодистрофией со смешанными симптомами выявлены мутации в генах XPB или XPD. Классические симптомы этого заболевания, по-видимому, являются следствием мутации в гене транскрипционного фактора TFIIH.
Получение мутантов с измененной NER у грызунов позволило разбить такие гены на 11 групп комплементации, большинство из которых соответствует группам комплементации XP и CS человека. Часть соответствующих генов человека удалось клонировать, используя их способность исправлять (комплементировать) генетические дефекты в культивируемых мутантных клетках грызунов. Эти гены получили название кросс-комплементирующих генов эксцизионной репарации ( ERCC — excision repair cross complementing ). Среди них гены XPE и ERCC6-ERCC11 не требовались для прохождения основных реакций эксцизионной репарации, и их функция неизвестна.

Эксцизионная репарация нуклеотидов (ЭРН) E. coli
У E. coli эксцинуклеаза формируется, в результате димеризации двух молекул белка UvrА в присутствии АТР и связывания с одной молекулой UvrB. Гетеротример UvrA2B связывается с ДНК и с помощью 5′-3′-ДНК-геликазной активности перемещается вдоль ДНК в поисках повреждения. Такова предполагаемая картина узнавания эксцинуклеазой UvrAВС неспецифического повреждения в ДНК [ Hoeijmakers J., 1993 ]. Результатом узнавания повреждения этим комплексом явится внедрение субъединицы UvrB в ДНК, сопровождающееся конформационными изменениями ДНК в сайте внедрения ( изломы , локальная денатурация), диссоциация обеих субъединиц UvrА из комплекса и последующее связывание с ним молекул UvrD и UvrC. Гетеродимер UvrBC из состава нового комплекса делает два разрыва в поврежденной нити ДНК на расстоянии 8 н. с 5′-конца от повреждения и 5 н. с 3′-конца, катализируемых субъединицами UvrC и UvrB соответственно, что приводит к появлению 12-13-мерного олигонуклеотида,
вытесняемого из комплекса с помощью геликазы UvrD. Образующаяся при этом брешь заполняется ДНК-полимеразой I, синтезирующей ДНК по неповрежденной матрице, и сшивается ДНК-лигазой. Описанный процесс зависит от АТР. Действительно, АТР стимулирует димеризацию молекул UvrA, гидролиз АТР необходим для образования комплекса UvrA2B и проявления его геликазной активности, АТР необходим для формирования комплекса UvrB-ДНК и, наконец, для описанной выше бимодальной инцизии ДНК [ Friedberg E.C., Walker G.C., ea., 1991 ]. У E. coli транскрипционно-зависимую ветвь ЭРН (ТЭРН) осуществляет продукт гена mfd (mutation frequency decline). Этот ген был открыт за 35 лет до того, как его продукт признали фактором TRCF. Последний способствует диссоциации РНК-полимеразы от дефектной транскрибируемой нити ДНК, и связывается с субъединицей UvrA эксцинуклеазного комплекса. Иными словами, именно белок Mfd отыскивает повреждения на транскрибируемой нити и направляет ТЭРН на эту мишень.
Согласно недавним наблюдениям, два главных белка системы ДКНО — MutL и MutS — необходимы для ТЭРН [106 Melon I., Champl G.N., 1996106]. Причина такой взаимосвязи систем ДКНО и ТЭРН или заимствования белков MutL и MutS для выполнения сходных функций пока остается загадочной, хотя сам факт несомненен и нашел подтверждение также и для белков Msh2, Mlh1, Pms1 и Msh3 у S. cerevisiae [ Sweder K.S., ea, 1996 ].
Эксцизионная репарация нуклеотидов (ЭРН) у человека
Большому прогрессу в раскрытии механизма ЭРН у эукариот мы обязаны наследственному заболеванию человека — пигментной ксеродерме .
Изучение молекулярных основ этого заболевания выявили их сопряженность с дефектами системы ЭРН, результатом чего и явилось раскрытие генетического контроля ЭРН. Комплементационный анализ различных клеточных линий ХР определил 8 комплементационных групп (7 от XPA до XPG и одна «вариантная форма» XPV) [ Friedberg E.C., Walker G.C., ea., 1991 ]), а комплементационная
коррекция возможных мутантных линий клеток китайского хомячка, чувствительных к УФ-свету, способствовала выявлению дополнительных генов системы ЭРН. Последние получили название гены ERCC (excision repair cross-complimenting), и поэтому в названии генов и белков ЭРН используются обе аббревиатуры. Хотя детали процесса ЭРН у человека не ясны, так как не определена роль целого ряда генов, в первом приближении он выглядит так ( табл. 3 ) [ Lehmann A.R., 1995 , Lindahl T., ea, 1997 , Hoeijmakers J., 1993 ]. Белок ХРА в комплексе с онДНК-связующим белком RPA ( репликационным белком А ), транслоцируясь вдоль онДНК, опознает конформационнoе повреждениe. Взаимодействуя через другой участок белка ХРА с базальным фактором транскрипции TFIIH (две из субъединиц которого, белки ХРВ и ХРD , обладают геликазной активностью с противоположной ориентацией раскручивания днДНК), они образуют комплекс, который расплетает ДНК вокруг повреждения (в состав этого комплекса входит и белок ХРС
с неясными функциями). Через третий участок белка ХРА к комплексу примыкает гетеродимер ERCC1-XPF , который вносит однонитевой разрыв в ДНК с 5′-конца на расстоянии 16-25 н. от повреждения, тогда как белок XPG , входящий в комплекс белков эксцинуклеазы через взаимодействие с белком RPA, делает надрез с 3′-конца на расстоянии 2-9 н. (в разрезании принимает участие и белок ХРС , а белок ХРЕ активирует реакцию). В результате бимодальной инцизии участок ДНК размером около 29 н. высвобождается, а образующаяся брешь ресинтезируется с помощью ДНК-полимеразы епсилон или ДНК-полимеразы дельта , сопутствующего репликации фактора PCNА , репликационного фактора C-RFС и ДНК-лигазы I .
Представленная картина во многом основана на реконструировании процесса в открытой системе с участием 10 хорошо очищенных белков [ Wood R.D., 1994 ]. Как видно, эукариотическая система ЭРН лишь функционально подобна прокариотической. В ней задействовано значительно больше белков, число которых должно еще возрасти
за счет белков, осуществляющих разборку и сборку хроматина. Раскрытие природы ТЭРН у человека также связывают с пониманием молекулярного дефекта,приводящего к развитию двух мультисистемных генетических заболеваний — синдрома Кокейна (СS) и трихотиодистрофии ( ТТD ). При обоих заболеваниях соматические клетки больных оказались неспособны к ТЭРН. Классические случаи CS оказались связанными с повреждениями в двух генах, CSA и CSB, а редкие смешанные формы CS+XP (CS с дополнительными симптомами ХР), с повреждениями в генах ХРВ, ХРD и ХРG. При ТТD дефекты были обнаружены также в генах XPB и XPD и в новом пока не клонированном гене ТТDА, продукт которого является частью корового домена транскрипционного фактора TFIIH [ Lehmann A.R., 1995 , Lindahl T., ea, 1997 ].
Фактор TFIIH состоит из 6 субъединиц, две из которых — белки XPB и XPD. Связываясь с белками РНК-полимеразного комплекса, кор TFIIH принимает участие в инициировании транскрипции [ Buratowski S., 1994 ], a вкупе с белками репарационного
комплекса кор этого фактора участвует в ЭРН. Если допустить, что белки CSA и CSB способствуют превращению транскрипционного комплекса в репарационнный [ Lindahl T., ea, 1997 , Bregman D.B., 1996 ], то следствием повреждения этих белков может стать дефектность в ТЭРН. Таким образом, либо прямыми воздействиями на коровый домен фактора TFIIH (мутации в генах XPB, XPD и TTDA), либо косвенными (через гены CSA и CSB) можно модифицировать способность этого фактора к диссоциации из РНК- полимеразного комплекса для участия в ТЭРН. Что касается белка XPG, то он, подобно своему гомологу из S. cereivisiae — белку Rad2 [ Bregman D.B., 1996 ], способен взаимодействовать c TFIIH, что допускает возможность его воздействия на TFIIH для участия в ТЭРН. Таковы гипотетические объяснения взаимосвязи молекулярных дефектов при CS и ТTD с нарушениями ТЭРН, которые могут быть полезными для раскрытия механизма ТЭРН у эукариот. Связь же между молекулярными дефектами и клиническими проявлениями
рассматриваемых наследственных заболеваний пока не имеет даже упрощенных толкований [ Kolodner R., 1995 ].
Так случилось, что изучение молекулярных механизмов ЭРН и ТЭРН на клетках человека развивались параллельно, или даже опережая исследования на популярной эукариотической модели дрожжей S. cerevisiae. В табл. 3 представлены известные функциональные аналоги системы ЭРН у дрожжей. Несомненно, однако, что при исследовании детального механизма ЭРН именно эта модельная система будет играть ведущую роль. Например, немаловажной особенностью системы ЭРН у E. coli является ее связь с SOS-функциями клетки. Действительно, центральные гены системы ЭРН, uvrA и uvrB, находятся под контролем SOS-регулона [ Friedberg E.C., Walker G.C., ea., 1991 ]. Системы, подобной SOS, у эукариот пока не обнаружено. Однако целый ряд генов системы ЭРН у дрожжей, таких, как RAD2, RAD7, RAD23, CDC8 и CDC9, индуцируется при повреждении ДНК, а последние два гена дополнительно регулируются клеточным циклом [ Friedberg
E.C., Walker G.C., ea., 1991 ].
Природу этой индукции еще предстоит выяснить.

Источники повреждения ДНК

ДНК постоянно подвергается воздействию физических, химических или биологических агентов, которые могут вызывать мутации и изменять генетическую информацию человека. Модификации ДНК могут быть вызваны эндогенными молекулами или механизмами клеточного метаболизма, ошибками в процессе репликации ДНК, некоторыми вирусными инфекциями и даже факторами окружающей среды, такими как ультрафиолетовый свет, химические агенты или ионизирующее излучение. Эти факторы мешают таким процессам, как транскрипция и репликация, и даже могут вызывать неконтролируемое деление клеток. 

Генетическая изменчивость также необходима для того, чтобы виды могли приспосабливаться к изменяющимся условиям; однако определенная генетическая информация имеет решающее значение, и ее модификация несовместима с выживанием организма.

Роль репарации

Чтобы максимально точно сохранить генетическую информацию, организм имеет сложные механизмы репарации ДНК. В большинстве случаев изменения ДНК не проявляются фенотипическими изменениями и не оказывают неблагоприятного воздействия на организм, но некоторые мутации могут стать фатальными, но их можно избежать как раз с помощью механизмов репарации, включающих сложные ферментативные системы, стремящиеся исправить мутации. 

Некоторые болезни человека, известные как синдромы нестабильности хромосом и некоторые виды рака связаны со сбоями в системах репарации ДНК.

Повреждения ДНК могут возникать спонтанно или могут быть вызваны воздействием мутагенных агентов. Дезаминирование, депуринизация и окислительное повреждение азотистых оснований — вот некоторые из повреждений, которые спонтанно возникают в ДНК. 

Типы репарации

Чтобы свести к минимуму повреждение генетического материала, в организме есть различные системы восстановления, которые активируются в зависимости от типа повреждения, нанесенного геному. 

Эти механизмы репарации можно разделить на четыре категории: прямая репарация, эксцизионная репарация, репарация несоответствия (ошибочное восстановление) и репарация двухцепочечных разрывов.

• Прямая репарация. 

Она включает в себя системы, которые непосредственно устраняют повреждение ДНК сразу после его возникновения. Этот тип восстановления не очень распространен, так как есть некоторые необратимые повреждения ДНК. Фотореактивация — это механизм, с помощью которого прокариотические организмы с помощью фермента фотолиазы распознают пиримидиновые димеры, продуцируемые УФ-светом. Этот фермент связывается с димером тимина и использует световую энергию для разрыва ковалентных связей между пиримидинами, заставляя их повторно дополняться антипараллельной цепью. Другим типом ферментов, участвующих в этой системе репарации, являются алкилтрансферазы, ферменты, которые удаляют алкильные группы гуанина и восстанавливают исходную структуру без необходимости изменения скелета ДНК.

• Эксцизионная репарация.

Базовая система эксцизионной репарации удаляет из генома поврежденные основания, образующиеся в результате алкилирования, ионизирующего излучения, окисления и дезаминирования. В эту систему вовлечены ферменты, называемые ДНК-гликозилазами, по меньшей мере восемь различных типов которых специфичны для каждого поражения. Восстановление осуществляется путем гидролиза гликозидной связи между азотистым основанием и сахаром, что приводит к удалению поврежденного основания. 

• Система восстановления несоответствия. 

Она основана на репарации несовпадающих оснований и коррекции петель, возникающих в цепи ДНК в результате проскальзывания полимеразы при репликации. Наиболее классическим примером этой системы репарации является система, используемая E. coli , в которой участвуют три белка: MutS, MutL и MutH. Белок MutS распознает несовпадающие основания и связывается с ними; MutL позволит сформироваться восстановительному комплексу и, в свою очередь, активирует MutH с эндонуклеазной активностью; Кроме того, это приведет к разрыву цепи, в которой расположено неправильно спаренное основание, а MutH обладает способностью различать цепь, которая должна быть восстановлена, с помощью явления гемиметилирования. 

• Репарация двухцепочечных разрывов. 

Это точная система восстановления, которая действует во время фазы S клеточного цикла. В процессе репликации эта система индуцируется необходимостью иметь правильную копию ДНК, которая служит шаблоном для восстановления утраченной информации в поврежденной цепи. 

• SOS-система.

Она реагирует на накопление одноцепочечной ДНК при блокировке процесса репликации. Он состоит из более чем 40 генов, которые активируются белком RecA ( рекомбинантный белок A ) у прокариот. 

Библиографическое описание:

Хестанова, М. С. К вопросу о механизмах репарации ДНК в клетке / М. С. Хестанова, С. Р. Кертанов, Е. А. Хестанова, Г. Г. Макиев. — Текст : непосредственный // Молодой ученый. — 2020. — № 3 (293). — С. 113-115. — URL: https://moluch.ru/archive/293/66334/ (дата обращения: 11.02.2023).

В данной статье обоснована необходимость более детального изучения механизмов репарации ДНК в клетках для обоснования этиологии и возможных генно-инженерных методов лечения различных заболеваний.

Ключевые слова: ДНК, репарация ДНК, прямая репарация, эксцизионная репарация, ДНК-лигазы, SOS-репарация.

Обмен нуклеотидов, в частности ДНК, является ключевым для нормальной жизнедеятельности клетки. Поэтому для поддержания гомеостаза клетки весьма необходима стабильная защита генома от спонтанных мутаций и случайных поломок.

Согласно имеющимся оценкам, в каждой клетке человеческого тела в сутки происходят десятки тысяч событий повреждений ДНК. Эндогенные повреждения в основном относятся к следующим категориям:

1) ошибочное включение в геном урацила или спонтанное деаминирование цитозина;

2) гидролиз или окисление любого из четырёх оснований активными формами кислорода, гормонами, активными формами азота, предшественниками гема или аминокислотами;

3) алкилирование пуринов и пиримидинов S-аденилметионином или другими агентами [7].

Также ежесуточно происходит спонтанное отщепление оснований, в количестве до 10 тысяч событий на весь объём генома. Сходные повреждения вызываются также экзогенными факторами, такими как ксенобиотики и радиация.

Молекулы ДНК являются для клетки настолько важными и уникальными, что в процессе эволюции в клетке выработалась сложная система репарации структуры ДНК, состоящая из нескольких механизмов и сотен белков, обеспечивающих процесс восстановления нормальной структуры ДНК. Основа всех репарационных механизмов — наличие в молекуле ДНК двух цепочек, таким образом в клетке есть 2 копии генетической информации: поврежденный участок восстанавливается по второй комплементарной сохранной цепи; если же повреждение затрагивает обе цепи ДНК, то используется информация для восстановления из гомологичной хромосомы [10].

Прямая репарация — наиболее простой и быстрый вариант для клетки устранить дефект за одну стадию. Однако с помощью реакций этого типа может быть исправлено небольшое число повреждений. К реакциям прямой репарации относятся фотореактивация пиримидиновых димеров, репарация АР-сайтов прямой вставкой пуринов и прямая репарация однонитевых разрывов ДНК [6].

Фотореактивация пиримидиновых димеров реализуется за счёт группы ферментов ДНК-фотолиаз. Фотолиазы активируются светом, с длиной волны 300–600 нм (видимая область). Фермент связывается с поврежденным участком. Затем после активации фотолиазы видимым светом происходит разрыв связей, возникших между пиримидиновыми кольцами ДНК. Фотолиазы были найдены у бактерий, дрожжей, мушки дрозофилы, некоторых видов иглокожих. Наличие фотолиаз у высших млекопитающих, включая человека, пока не доказано.

Репарация АР-сайтов прямой вставкой пуринов реализуется при участии фермента ДНК-инсертаза [4]. Инсертаза комплементарно присоединяет основание к дезоксирибозе и структура ДНК приобретает исходный вид. При этом типе репарации нет необходимости в разрезании цепи ДНК, вырезать неправильный нуклеотид и репарировать разрыв, однако данный механизм работает медленно и таким образом может быть исправлено небольшое число поломок.

Прямая репарация однонитевых разрывов ДНК осуществляется за счёт работы одного фермента — ДНК-лигазы. Данная группа ферментов катализирует ковалентное сшивание цепей ДНК в дуплексе при репликации, репарации и рекомбинации. Они образуют фосфодиэфирные мостики между 5′-фосфорильной и 3′-гидроксильной группами соседних дезоксинуклеотидов в местах разрыва ДНК. Реакция протекает с затратой энергии АТФ. Помимо прямой репарации, ДНК-лигазы играют важную роль в механизмах эксцизионной репарации.

Эксцизионная репарация — более сложный механизм восстановления структуры ДНК, при котором поврежденные участки извлекаются из цепи ДНК; при этом могут удаляться даже соседние с повреждёнными участками нуклеотиды. В образовавшийся промежуток вставляется недостающий участок. Для эксцизионной репарации необходима комплементарная цепь ДНК [9]. Несмотря на разнообразие типов эксцизионной репарации и белков, участвующих в ней, можно выделить общие этапы:

1) распознавание повреждения с помощью ДНК-гликозилазы [5];

2) разрезание нити ДНК с помощью эндонуклеаз;

3) удаление повреждённого участка посредством различных экзонуклеаз;

4) репаративный синтез на неповрежденной матрице при участии ДНК-полимераз.

Для Е.coli был описан особый вид репарации — SOS-репарация [1]. Это целая система белков, активирующихся при угрозе гибели клетки. Система несовершенна, так как происходит вставка некомплементарных нуклеотидов. Однако этот механизм необходим для осуществления митоза и проведения репликации даже при значительных повреждениях ДНК.

В части процессов репарации в клетке также участвует и рекомбинация. Этот механизм восстановления ДНК является приоритетным при возникновении двунитевых разрывов и из-за обширности требует более детального рассмотрения.

У млекопитающих найдено несколько различных видов ДНК-лигаз [8]:

– ДНК-лигаза I связывает фрагменты Оказаки в ходе репликации ДНК и вносит свою лепту в реакции эксцизионной репарации.

– ДНК-лигаза II — недостаточно изучена; имеются две теории образования этого фермента, связанные с лигазой III и альтернативным сплайсингом.

– ДНК-лигаза III также задействована в реакциях эксцизионной репарации и в рекомбинации.

– ДНК-лигаза IV — катализатор для конечного этапа non-homologous end joining — NHEJ двухнитевых разрывов ДНК. Также это тип ферментов принимает участие в рекомбинации генов иммуноглобулинов.

Основные структуры, осуществляющие репарацию — это различные группы ферментов. У разных биологических видов обнаружены разные типы ферментов в пределах одной группы. Некоторые ферменты образуют большие комплексы с различными видами ферментной активности.

Как мы видим, все разнообразие механизмов связано с огромным множеством ферментов, вносящих свой вклад в реакции репарации. С учетом развития молекулярной диагностики и генной терапии более детальное изучение механизмов репарации ДНК и структур, участвующих в них, является весьма приоритетным и многообещающим как для научного обоснования этиологии различных генетических [3] и онкологических заболеваний [2], так и для практического применения в качестве мишеней для лекарственных препаратов.

Литература:

1. Ушаков В. Ю.SOS-система репарации ДНК у бактерий (обзор) // Вестник Пермского университета. — 2010. — Вып. 2. — С. 19–30.
2. Bartkova J., Horejsi Z., Koed К., et al. DNA damage response as a candidate anti-cancer barrier in early human tumorigenesis // Nature. — 2005. — Vol. 434. — Р.864–870.
3. Caldecott K. W. Single-strand break repair and genetic disease // Nat. Rev. Genet. — 2008. — Vol. 9. — Р.619–631.
4. Flaherty D. M., Martha М. М., Hunninghake G. W. AP Endonucleases and the Many Functions of Ref-1 // American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. — 2001. — Vol. 25. № 6. — Р.664–667.
5. Scharer O. D., Jiricny J. Recent progress in the biology, chemistry and structural biology of DNA glycosylases // Bioessays. — 2001. — Vol. 23. — P.270–281.
6. Основы биохимии Ленинджера: в 3 т. Т. 3: Пути передачи информации / Д. Нельсон, М. Кокс; пер. с англ. — 3-е изд., испр. — М.: Лаборатория знаний, 2017. — 448 с. — с. 66–79.
7. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки: В 3-х т. 2-е изд., перераб. М75 и доп. Т.1. Пер. с англ. -М. Мир, 1994. -517 c
8. Клаг, Уильям С. Основы генетики / У. С. Клаг, М. Р. Каммингс. — М.: Техносфера, 2007. — 896. с
9. Коничев С. А. Молекулярная биология / С. А. Коничев, Г. А. Севастьянова. — М.: Академия, 2005. — 400 с.
10. Разани С. В. Хроматин: упакованный геном / С. В. Разин, А. А. Быстрицкий. — М.: Бином. Лаборатория знаний, 2009. — 176 с.

Актуальность: Данная тема является актуальной по причине того, что репарация является свойством живой клетки бороться с различными повреждениями ДНК, чтобы сохранить целостность ДНК. Данная тема затрагивает одну из важных задач современной медицины.

Цель: понять, как нарушается целостность генетического материала клетки и какие существуют восстановительные механизмы ДНК и как они работают.

Задачи:

1. Изучить, что такое репарация.

2. Разобрать, как происходит повреждение ДНК и по каким причинам

3. Выяснить, как работают репарационные механизмы ДНК

Содержание………………………………………………………………….стр.

1. Введение………………………………………………………………….…3

2. Нарушения в ДНК…………………………..…………………………….…4

3. «Световое восстановление»………………………………………….……..5

4. «Темновое восстановление»……………………………………………….6

5. Система репарации………………………………………………….……..7

6. Классификация репарации………………………………………………..8

7. Виды репарации……………………………………………………………9

8. Интересные факты о репарации………………………………….………11

9. Заключение………………………………………………………………..12

10. Список литературы………………………………………………………13

Введение

Репарация (от лат. reparatio — восстановление) — особая функция клеток, заключающаяся в способности исправлять химические повреждения и разрывы в молекулах ДНК, повреждённых при нормальном биосинтезе ДНК в клетке или в результате воздействия физических или химических реагентов. Осуществляется специальными ферментными системами клетки. Ряд наследственных болезней (напр., пигментная ксеродерма) связан с нарушениями систем репарации. В окружающем мире существует множество факторов, способных вызвать необратимые изменения в живом организме. Чтобы сохранить свою целостность, избежать патологических и несовместимых с жизнью мутаций, должна существовать система самостоятельного восстановления.

Нарушения в ДНК

Молекула дезоксирибонуклеиновой кислоты может быть разорвана как в ходе биосинтеза, так и под влиянием вредных веществ.

Источники повреждения ДНК:

— Ультрафиолетовое излучение

— Радиация

— Химические вещества

— Ошибки репликации ДНК

— Апуринизация — отщепление азотистых оснований от сахарофосфатного остова

— Дезаминирование — отщепление аминогруппы от азотистого основания

К негативным факторам, в частности, относят температуру или физические силы различного происхождения. Если разрушение произошло, клетка запускает процесс репарации. Так начинается восстановление исходной структуры молекулы ДНК. За репарацию отвечают особые ферментные комплексы, присутствующие внутри клеток. С невозможностью отдельных клеток осуществлять восстановление связаны некоторые заболевания.

«Световое восстановление»

Впоследствии исследования Кельнера получили свое логическое продолжение в работах американских биологов Сетлоу, Руперта и некоторых других. Благодаря труду этой группы ученых было достоверно установлено, что фотореактивация является процессом, который запускается благодаря особому веществу – ферменту, катализирующему расщепление димеров тимина. Именно они, как выяснилось, образовывались в ходе экспериментов под воздействием ультрафиолета. При этом яркий видимый свет запускал действие фермента, который способствовал расщеплению димеров и восстановлению первоначального состояния поврежденных тканей. В данном случае речь идет о световой разновидности восстановления ДНК. Определим это более четко. Можно сказать, что световая репарация – это восстановление под воздействием света первоначальной структуры ДНК после повреждений. Однако данный процесс не является единственным, способствующим устранению повреждений.

«Темновое восстановление»

Спустя некоторое время после открытия световой была обнаружена темновая репарация. Это явление происходит без какого-либо воздействия световых лучей видимого спектра. Данная способность к восстановлению обнаружилась во время исследования чувствительности некоторых бактерий к ультрафиолетовым лучам и ионизирующему излучению. Темновая репарация ДНК – это способность клеток убирать любые патогенные изменения дезоксирибонуклеиновой кислоты. Но следует сказать, что это уже не фотохимический процесс, в отличие от светового восстановления.

Механизм «темнового» устранения повреждений Наблюдения за бактериями показали, что спустя некоторое время после того, как одноклеточный организм получил порцию ультрафиолета, вследствие чего некоторые участки ДНК оказались поврежденными, клетка регулирует свои внутренние процессы определенным образом. В результате измененный кусочек ДНК просто отрезается от общей цепочки. Получившиеся же промежутки заново заполняются необходимым материалом из аминокислот. Иными словами, осуществляется ресинтез участков ДНК. Открытие учеными такого явления, как темновая репарация тканей, – это еще один шаг в изучении удивительных защитных способностей организма животного и человека.

Система репарации

Эксперименты, позволившие выявить механизмы восстановления и само существование этой способности, проводились с помощью одноклеточных организмов. Но процессы репарации присущи живым клеткам животных и человека. Некоторые люди страдают пигментной ксеродермой. Это заболевание вызвано отсутствием способности клеток ресинтезировать поврежденную ДНК. Ксеродерма передается по наследству. Из чего же состоит репарационная система? Четыре фермента, на которых держится процесс репарации – это ДНК-хеликаза, -экзонуклеаза, -полимераза и -лигаза. Первый из этих соединений способен распознавать повреждения в цепи молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты. Он не только распознает, но и обрезает цепь в нужном месте, чтобы удалить измененный отрезок молекулы. Само устранение осуществляется с помощью ДНК-экзонуклеазы. Далее происходит синтез нового участка молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты из аминокислот с целью полностью заменить поврежденный отрезок. Ну и финальный аккорд этой сложнейшей биологической процедуры совершается с помощью фермента ДНК-лигазы. Он отвечает за прикрепление синтезированного участка к поврежденной молекуле. После того как все четыре фермента сделали свою работу, молекула ДНК полностью обновлена и все повреждения остаются в прошлом. Вот так слаженно работают механизмы внутри живой клетки.

Классификация репарации

На данный момент ученые выделяют следующие разновидности систем репарации. Они активируются в зависимости от разных факторов. К ним относятся: реактивация, рекомбинационное восстановление, репарация гетеродуплексов, эксцизионная репарация, воссоединение негомологичных концов молекул ДНК. Все одноклеточные организмы обладают как минимум тремя ферментными системами. Каждая из них обладает способностью осуществлять процесс восстановления. К этим системам относят: прямую, эксцизионную и пострепликативную. Этими тремя видами восстановления ДНК обладают прокариоты. Что касается эукариот, то в их распоряжении находятся дополнительные механизмы, которые называются Miss-mathe и Sos-репарация. Биология подробно изучила все эти виды самовосстановления генетического материала клеток.

Виды репарации

1. Прямая репарация — наиболее простой путь устранения повреждений в ДНК, в котором обычно задействованы специфические ферменты, способные быстро (как правило, в одну стадию) устранять соответствующее повреждение, восстанавливая исходную структуру нуклеотидов. Так действует, например, O6-метилгуанин-ДНК-метилтрансфераза, которая снимает метильную группу с азотистого основания на один из собственных остатков цистеина.

2. Эксцизионная репарация (англ. excision — вырезание) включает удаление повреждённых азотистых оснований из ДНК и последующее восстановление нормальной структуры молекулы. Эксцизионная репарация (excision repair): процесс с участием ферментативной системы, которая удаляет короткую однонитевую последовательность двунитевой ДНК , содержащей ошибочно спаренные или поврежденные основания , и замещает их путем синтеза последовательности, комплементарной оставшейся нити. Эксцизионная репарация является наиболее распространенным способом репарации модифицированных оснований ДНК. Этот тип репарации базируется на распознавании модифицированного основания различными гликозилазами, расщепляющими N-гликозидную связь этого основания с сахарофосфатным остовом молекулы ДНК. При этом существуют гликозилазы, специфически распознающие присутствие в ДНК определенных модифицированных оснований (оксиметилурацила, гипоксантина, 5-метилурацила, 3-метиладенина, 7-метилгуанина и т.д.). Для многих гликозилаз к настоящему времени описан полиморфизм, связанный с заменой одного из нуклеотидов в кодирующей последовательности гена. Для ряда изоформ этих ферментов была установлена ассоциация с повышенным риском возникновения онкологических заболеваний.

3. Пострепликативная репарация Tип репарации, имеющей место в тех случаях, когда процесс эксцизионной репарации недостаточен для полного исправления повреждения: после репликации с образованием ДНК, содержащей поврежденные участки, образуются одноцепочечные бреши, заполняемые в процессе гомологичной рекомбинации при помощи белка. Пострепликативная репарация была открыта в клетках E.Coli, не способных выщеплять тиминовые димеры. Это единственный тип репарации, не имеющий этапа узнавания повреждения.

Интересные факты о репарации

1. Полагают, что от 80 % до 90 % всех раковых заболеваний связаны с отсутствием репарации ДНК[4].

2. Повреждение ДНК под воздействием факторов окружающей среды, а также нормальных метаболических процессов, происходящих в клетке, происходит с частотой от нескольких сотен до 1000 случаев в каждой клетке, каждый час.

3. По сути ошибки в репарации происходят так же часто как и в репликации, а при некоторых условиях даже чаще.

4. В половых клетках сложная репарация, связанная с гомологичной рекомбинацией не происходит из-за гаплоидности генома этих клеток.

Заключение

Репарация – это обязательное условие нормального функционирования организма. Подвергаясь ежедневно и ежечасно угрозам повреждений и мутаций ДНК, многоклеточная структура приспосабливается и выживает. Это происходит в том числе и за счет налаженной системы репарации. Отсутствие нормальной восстановительной способности вызывает болезни, мутации и другие отклонения. К ним относятся различные патологии развития, онкология и даже само старение. Наследственные болезни вследствие нарушений репарации могут приводить к тяжелым злокачественным опухолям и другим аномалиям организма. Сейчас определены некоторые заболевания, вызываемые именно сбоями систем репарации ДНК. Это такие, например, патологии, как синдром Кокейна, ксеродерма, неполипозный рак толстой кишки, трихотиодистрофия и некоторые раковые опухоли.

Список литературы

1. Кирпичев А.С., Севастьянова Г.А. Молекулярная биология М. AKADEMA. 2005г.

2. С.Коничев, Г.А.Севастьянова Молекулярная биология. — Москва: Академия, 2003г.

3. С.Г. Инге-Вечтомов. Генетика с основами селекции. — Москва: Высшая школа, 1989г.

4. Кирилл Стасевич Как клетка чинит свою ДНК. Наука и жизнь. — 2015г.

5. Б. Льюин. Гены 1987г.