Как изменить генетический код человека

В конце XX века тогда еще начинающие британские биохакеры совершили настоящий прорыв в генетике и предоставили любому человеку возможность с помощью ДНК-теста узнать больше о своих далеких предках и загадочной наследственности. Тогда, правда, только избранные могли объяснить, зачем и кому это нужно, — генетика была интересна лишь узкой группе специалистов, работающих с редкими заболеваниями. Но теперь за простым любопытством стоит более глобальная задача — разобраться в своей наследственности. А причина этому — надвигающийся тренд на тотальное оздоровление, исцеление и персонализированную медицину.

Сегодня эксперты уже не сомневаются в том, что генетика — основополагающая наука медицины будущего, хотя ее технологии и без того кажутся чем-то из мира научной фантастики. Перспективы развития генетики в России обсудят на площадках форума «БИОТЕХМЕД», который пройдет 16 и 17 сентября в Геленджике. В преддверии этого события «РБК Стиль» пообщался с одним из экспертов форума — врачом-генетиком Екатериной Захаровой — и узнал у нее, как работает ДНК, какие особенности мы можем унаследовать от родителей и безопасно ли вмешательство генетиков в организм.

Екатерина Захарова
Заведующая лабораторией наследственных болезней обмена веществ ФГБНУ «Медико-генетический научный центр им. академика Н.П. Бочкова», член экспертного совета по редким болезням при комитете Государственной думы по охране здоровья

Как устроена клетка

Со школьных времен всем известно, что организм человека состоит из множества клеток, в каждой из которых есть ядро — именно там хранится генетическая информация. Ее мы наследуем от родителей и дальше передаем своим детям. В материальном обличии эта информация представлена в виде той самой нити ДНК — дезоксирибонуклеиновой кислоты. Эта макромолекула была открыта достаточно давно, но то, что именно в ней хранится генетическая информация, стало известно только в XX веке.

Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) — макромолекула, которая хранит и передает из поколения в поколение генетическую программу функционирования живых организмов. Биологическая информация в ДНК представлена в виде уникального генетического кода, состоящего из последовательности нуклеотидов.

Зачем нужна ДНК

Говоря о том, зачем нам ДНК и что она делает, можно привести аналогию: каждый белок в нашем организме синтезируется по определенному «рецепту». В нем указано, сколько должно быть аминокислот, в какой последовательности они будут соединяться и куда дальше последуют. В таком случае ДНК — это поваренная книга, в которой записаны рецепты всех наших белков, а мутация — это повреждение белка или изменение текста поваренной книги. Если в рецепте появляется опечатка, то белок получается «неправильный» и не выполняет свои функции должным образом, отчего страдает как клетка, так и весь организм, что приводит к развитию заболевания.

Во всех наших клетках хранятся одинаковые гены. Но функции у клеток разные: одни, например, синтезируют гемоглобин, другие занимаются мышечными белками, третьи — нервными. Это обеспечивается с помощью системы регуляции активности генов: она способна «включать» одни гены и оставлять в молчании другие.

Чем генетика отличается от наследственности

Генетика — большая и очень разнообразная наука. Клиническая генетика изучает, как проявляются наследственные болезни, популяционная — наше происхождение и особенности каждого народа. А вот наследственность — понятие уже более узкое. Люди давно заметили, что есть признаки, которые ярко проявляются у представителей одной семьи и передаются из поколения в поколение.

Если вспомнить живопись и портреты членов династии испанских Габсбургов, то многим сразу придут на ум их наследственные приметы: выступающая «габсбургская губа» и гипертрофированная нижняя челюсть, которая, говорят, даже мешала монарху нормально пережевывать пищу. Совершенно очевидно, что эти признаки связаны с изменениями определенных генов в известном роду.

Что еще хранится в ДНК

Информация, закодированная в ДНК, способна рассказать как о заболеваниях, так и о цвете волос, форме глаз, группе крови и даже вкусовых предпочтениях. Например, в ходе генетических исследований ученые обнаружили, что всех людей можно разделить на две категории: тех, кто любит капусту брокколи, и тех, кто ее просто ненавидит. Оказалось, что у второй группы есть определенные повреждения в гене, ответственные за восприятие этого вкуса, — им брокколи кажется горькой и неприятной.

В ДНК также могут быть записаны наши пагубные привычки, склонность к полноте или употреблению алкоголя. Изменения в некоторых генах делают нас более восприимчивыми к этим факторам. Но, как правило, за них отвечает не один, а сразу множество взаимосвязанных генов. Кроме того, врачи уверены, что более существенную роль в данном вопросе играют воспитание и другие социальные факторы.

Можно ли унаследовать интеллектуальные способности

Считается, что интеллектуальные и эмоциональные способности будущего ребенка определяются большим набором генов, и предсказать, какую именно комбинацию они составят, наука пока не в состоянии. Поэтому утверждать, что у гениальных родителей рождаются только гениальные дети, нельзя. Хотя такой миф до сих пор существует: некоторые женщины даже продолжают выбирать себе избранника, исходя из его интеллектуальных способностей, или искать какого-нибудь выдающегося донора — нобелевского лауреата.

Однако есть теория, согласно которой IQ будущего ребенка в большей степени определяется матерью, поскольку в тех областях мозга, которые отвечают за интеллект, чаще активируется ген, наследуемый от нее. А вот за эмоциональное состояние и характер чаще отвечает отец. И в этом случае нобелевский лауреат может оказаться не самым лучшим кандидатом на отцовство.

Как наследуются болезни

Болезни могут наследоваться по-разному. В некоторых случаях патология должна быть у одного из родителей, который, в свою очередь, передает ее детям (с вероятностью 50%). В других болезнь наследуется только по женской линии, и в итоге страдают ей мальчики, а девочки остаются ее здоровыми носительницами. Есть и заболевания, которые переносят оба родителя — у них больной ребенок может появиться на свет только в 25% случаев.

Кроме того, существует множество патологий, которые не наследуются, а появляются случайным образом. Например, в одной половой клетке матери или отца происходят изменения без особых на то причин, и в семье, где никогда не встречались с генетическими заболеваниями, может родиться малыш с синдромом Дауна (хромосомной патологией) или ахондроплазией — моногенным заболеванием, которое проявляется как карликовость. В такой ситуации одна из главных задач врача-генетика — выяснить, как наследуется болезнь, проинформировать семью о возможных рисках рождения больного ребенка, а также рассказать, что можно сделать, чтобы ребенок родился здоровым.

Наследуются ли онкологические заболевания

Большинство онкологических заболеваний — это мутации в генах. Однако они возникают не в половых, а в соматических клетках и не передаются по наследству. В таком случае на их развитие большое влияние оказывают именно внешние факторы: курение, радиация и канцерогенные химические вещества.

Но, к сожалению, есть отдельные виды онкозаболеваний, к которым приводит мутация в генах: они переходят от родителей к ребенку. Самый известный пример — рак молочной железы, за появление которого отвечают гены BRCA1 и BRCA2. В группу риска попадает подавляющее большинство девушек и женщин, у которых в семье были случаи рака молочной железы, поскольку наличие мутации в генах сильно повышает риск развития этого заболевания в определенном возрасте. Это означает, что рак может появиться вне зависимости от образа жизни, занятий спортом и сбалансированности рациона.

Как разгадать свои гены

Попытаться разобрать загадочную ДНК и узнать больше о своих генах можно при помощи генетических тестов. Как правило, их рекомендуют проводить в первую очередь тем семьям, где уже были зафиксированы случаи наследственных заболеваний. Но есть скрининг-тесты, которые проводятся для всех, вне зависимости от того, есть ли вероятность возникновения наследственного заболевания. Например, сейчас у всех беременных женщин есть возможность сдать анализы на определение генетических заболеваний у эмбриона. Скрининг на раннем сроке проводится специально для того, чтобы определить, входят ли будущая мама и ее малыш в группу риска. Дальше назначаются дополнительные обследования, которые подтверждают или опровергают развитие патологии. В ходе беременности не менее важно своевременно делать УЗИ, потому что пороки развития у плода встречаются намного чаще, чем любые наследственные заболевания.

Будущие родители должны осознавать, что комбинации их генов не всегда могут привести к идеальному результату. Но с некоторыми из наследственных патологий ребенок может жить совершенно нормально, поэтому пугаться их не стоит.

Может ли врач исправить наследственность

Если представить, что врач на начальном этапе сможет скомбинировать гены так, чтобы исправить недочеты в хромосомах будущего ребенка, родители, наверное, согласятся. Хотя стоит взять в расчет то, что часто двигателями прогресса, науки и искусства становятся именно неординарные люди. У талантливых художников, поэтов или музыкантов неоднократно были зафиксированы особенности развития, и если бы отбор по таким критериям существовал сотни лет назад, то мир лишился бы практически всех гениев.

Сейчас мы знаем многое о геноме человека и уже научились читать его последовательность. Но вот понять смысл этого «текста» можем далеко не всегда. Так же, как не всегда знаем, повлияет ли положительно наше вмешательство в структуру одного гена на работу других. Больше того, функция многих участков ДНК до сих пор остается не изучена.

ЭКО и дети из пробирки

Когда начинаешь работать с чем-то малоизвестным (а это часто встречается в генетике), всегда возникает вопрос о том, что делать правильно и этично, а что нет. Сегодня в цивилизованных странах накладывается запрет на генетические манипуляции с половыми клетками, потому что мы не знаем, как их изменения могут передаваться дальше и к каким последствиям это приведет. И, конечно, нельзя проводить эксперименты на живых эмбрионах.

Пока что в случае обнаружения какого-либо генетического заболевания врач может только предложить пренатальную или предимплантационную диагностику — метод, позволяющий произвести генетическую экспертизу одной клетки эмбриона перед процедурой ЭКО (экстракорпорального оплодотворения). Задача такой диагностики — предоставить возможность рождения здоровых детей в семьях, где существует высокий риск рождения ребенка с тяжелыми заболеваниями. Но у любых современных технологий, включая ЭКО, есть свои риски. Даже после подсадки эмбрион может не прижиться. При этом среди нас уже растет множество детей, которые появились благодаря искусственному оплодотворению, и они совершенно ничем не отличаются от обычных малышей.

Что происходит с эволюцией

В глобальном плане человеческие гены могут со временем мутировать и видоизменяться. И онкологические заболевания — одна из самых ярких иллюстраций этого процесса. Теперь, когда продолжительность жизни выросла, увеличилась и вероятность появления опухолей. С другой стороны, прогресс тоже не стоит на месте: появляется все больше методов диагностики и лечения, которые помогают справляться с тяжелыми недугами.

Еще до недавнего времени выявление генетических заболеваний было непростой задачей. Однако методы секвенирования уже позволяют «читать» ДНК не по одной букве-нуклеотиду, а разбирать все буквы одновременно. Так можно выявлять и мутации, передающиеся по наследству и новые, от появления которых не застрахован никто. Конечно, некоторые окружающие факторы тоже могут влиять на то, как ведут себя наши гены. Это и экология, и пища, и привычки. Их изучением наука тоже занимается активно.

Куда движется генетика

Генетика становится всеобъемлющей: по одной капле крови теперь можно определить все, что веками записывалось в ДНК человека. Вместо сотрудников диагностикой занимаются математические алгоритмы. Вполне возможно, что через некоторое время генетическая экспертиза станет обычным делом и без нее не будет обходиться даже рядовой прием у врача-терапевта.

И наверняка будет создаваться все больше препаратов, основанных на принципах персонализированной медицины, которые подбираются в зависимости от особенностей метаболизма пациента и его мутаций. Что же касается детей на заказ, то наука должна помогать нам корректировать гены только в случаях тяжелых наследственных заболеваний, а не для того, чтобы выбирать пол ребенка и цвет его глаз или особенности поведения. В этом вопросе нужно позволить природе комбинировать наши гены для появления на свет совершенно неповторимого чудесного существа — человека. 

Возможность изменять фрагменты ДНК всегда была святым Граалем биотехнологии и медицины. CRISPR позволяет делать это с невиданной ранее скоростью и эффективностью. Считайте, что биологи раньше работали на пишущей машинке, а благодаря CRISPR в одночасье пересели на MacBook. Не зря открытие этого метода в 2020 году удостоилось Нобелевской премии по химии.

Под катом — рассказ о появлении CRISPR, принципах работы и применении в настоящем и будущем. Да, вы все верно поняли, это про редактирование коров, синюю клубнику и арбузы размером со сливу с Aliexpress.

Эта статья — переработанная версия лекции Бориса Климовича, научного сотрудника Университетской клиники Тюбингена и Немецкого центра исследований рака (DKFZ), которая прошла в конце ноября при поддержке Точки кипения ЯрГУ.

Признание к CRISPR пришло в 2012 году — после публикации нобелевской работы. Но, как это обычно бывает в науке, открытие — не личная заслуга пары авторов. В этот раз участников событий было много, и началось все вовсе не с генетики.

Все началось с «грязекопателя»

Аббревиатура CRISPR появилась в конце 80-х в ходе исследований солончаков рядом с испанским городом Аликанте. Аспирант Франсиско Мохика изучал архебактерий, живущих в соленой воде, и наткнулся на странные палиндромные последовательности в их геноме. 

Фрагменты длиной около 30 нуклеотидов повторялись много раз и отделялись друг от друга уникальными участками ДНК примерно такой же длины.

Упрощенно обнаруженная структура выглядела так:

На тот момент никто не понимал, зачем нужны эти структуры. Сошлись на том, что они необходимы для некой регуляции (стандартное «объяснение» в биологии, когда ничего не понятно). Структурам сначала дали название SRSR (Short Regularly Spaced Repeats), а потом переименовали в CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats).

Продолжив работу в том же направлении, Мохика нашел похожие повторы у многих других бактерий. И эта закономерность привлекла внимание.

В 2002 году рядом с CRISPR-массивами у всех бактерий выявили похожие на них структуры — группу белок-кодирующих генов, которую назвали «очень оригинально» — CAS (CRISPR-Associated Genes).

Продвинуться дальше помог своего рода «генетический Google»: GenBank, куда ученые складируют все прочитанные последовательности ДНК. К началу 2000-х годов там накопилось уже достаточно информации, чтобы при помощи алгоритмов BLAST найти, в каких организмах встречаются похожие CRISPR-последовательности.

Поиск выявил интересную вещь: фрагменты CRISPR встречаются в ДНК бактериофагов — вирусов, которые инфицируют бактерии и убивают их. Получается, что бактерии хранят внутри себя фрагменты ДНК своих злейших врагов. 

Так возникла ключевая догадка о том, что CRISPR — это иммунная память бактерий, сохраняющих информацию о вирусах, которыми болели.

Сформулировав эту теорию, Мохика сел писать статью, которую отправил в самый престижный биологический журнал — Nature. Статью отклонили. Затем он пытался ее пристроить в четыре других журнала, но успеха добился лишь через 18 месяцев. 

Кстати, в этом он далеко не рекордсмен. В свое время работу Линн Маргулис, предложившую популярную нынче гипотезу симбиогенеза, отклоняли 15 раз! Можно сказать, что Мохика повезло. Его работу опубликовали быстрее, а идея нашла своих сторонников.

Основная функция CRISPR

Следующий шаг в развитии технологии сделал микробиолог Филипп Хорват. В своей докторской работе он исследовал закваски к эльзасской квашеной капусте, а если точнее — молочнокислые бактерии, которые ее квасят.

После докторской он ушел в молочную промышленность, где столкнулся с проблемой бактериофагов. Они сильно вредили заквасочным культурам, производители молочных продуктов несли огромные убытки. Ховарт искал способы сделать закваски устойчивыми к бактериофагам и наткнулся на работы о CRISPR. Исследуя эту тему, он доказал, что устойчивые к вирусам бактерии перенимают часть их ДНК.

Бактериальная клетка, которая перенесла инфекцию бактериофагом и не умерла, нарезает его геном на мелкую «вермишель», встраивает в CRISPR-массивы и передает эту информацию своим потомкам, которые становятся устойчивыми к бактериофагу.

Позже компанию, в которой работал Хорват, купила корпорация DuPont. А поскольку она производит примерно 40% заквасок для современной молочной промышленности, вы практически наверняка сталкивались с CRISPR в составе йогуртов, пиццы или сыра.

Работы Хорвата показали, что CRISPR-массивы — это действительно иммунная система бактерий.
Это работает так: кусочки ДНК бактериофагов сохраняются в ДНК бактерий в виде CRISPR-массивов. Затем они превращаются в РНК. В этом же куске генома у бактерий кодируется так называемая тракр-РНК (tracrRNA). Вместе они формируют guideRNA, или наводящую РНК, которая затем объединяется с белком Cas9.
Cas9 — это нуклеаза, фермент, который умеет резать ДНК. При помощи guideRNA этот фермент наводится на специфический сегмент в ДНК бактериофага, садится на него и разрезает, как ножницами, чем нарушает размножение вируса.

Нобелевская статья по редактированию генов

Когда две замечательные женщины-ученые Эммануэль Шарпантье и Дженнифер Даудна встретились на конференции в Коста-Рике, предназначение CRISPR уже было известно. Им пришла в голову смелая идея: приспособить эту систему для резки любой ДНК. Они объединили силы своих лабораторий и в 2012 году в журнале Science опубликовали результаты работы.

Им удалось объединить две РНК в одну single guide RNA и показать, что механизм резки работает.

Тут надо пояснить, что резка — это и есть основной этап редактирования ДНК. А CRISPR — генетические ножницы. Все детали ниже.

За эту работу в 2020 году они получили Нобелевскую премию по химии.

Это событие уникально по двум параметрам. 

Во-первых, это первая премия, которую получили две женщины без сопровождающей мужской компании.
Во-вторых, эта премия очень «быстрая». С момента публикации до ее присуждения прошло всего восемь лет.

Влияние технологии CRISPR проще всего проиллюстрировать, показав частоту упоминаний этой аббревиатуры в научной литературе, которая после 2012 года растет как на дрожжах.

Второй показатель — количество патентов.

Эта статистика показывает, насколько все изменилось. Технологии редактирования генома предлагались и ранее, но ни одна из них не достигла такого успеха.

Как происходит редактирование ДНК

Первая нобелевская статья демонстрировала редактирование ДНК в пробирке. Перед учеными стояла амбициозная задача — повторить процесс в клетках человека. Фэн Чжан из MIT оптимизировал процесс, сделав его совместимым с живыми клетками, у которых есть ядра.

Фэн Чжан перенес технологию из пробирки в живые клетки

В 2013 году после публикации работы Чжана эта тема стала доминирующей. Появились сообщения о том, что отредактировали геном человека, мыши, дрожжей, ниматод, дрозофилы, резуховидки Таля, рыбки данио-рерио — всех имеющихся у биологов модельных объектов.

Важно понимать, что ДНК — это очень стабильная молекула. Ее можно кипятить или оставлять лежать в земле на сотни тысяч лет.

Самая старая секвенированная ДНК на сегодняшний день имеет возраст 1,7 млн лет.

Однако молекула ДНК очень чувствительна к разрывам. Если это случается, клетка запускает процесс починки ДНК. Он может идти двумя путями:

• Не гомологичный вариант — когда место разрыва устраняется с дефектами. В результате в ДНК может появиться маленькая вставка или произойти потеря фрагмента. Генетический код — это типлеты, то есть три нуклеотида кодируют одну аминокислоту. Если вы вырезали два или вставили четыре нуклеотида, нарушится последовательность, кодирующая белок. Возникнет сдвиг рамки считывания, в результате которого ген фактически перестанет выполнять свою функцию, так как клетка не сможет использовать его информацию, чтобы синтезировать функциональный белок.

Сломать ген можно было и раньше, просто это довольно трудоемко: надо облучать гены радиацией, месяцами искать мутации. Благодаря CRISPR процесс стал гораздо проще.

• Гомологичная рекомбинация. У всех животных в клетках как минимум две копии каждой хромосомы. Если возникает разрыв, клетка может использовать вторую хромосому и на ее основании достроить поврежденный участок — скопировать его в поврежденную хромосому. В этой ситуации клетку можно обмануть и подсунуть ей вместо второй хромосомы похожий фрагмент ДНК, но с мутацией. Тогда клетка починит разрыв, встроив в него то, что мы подсунули, — так называемую матрицу.

За счет прицельно вносимого разрыва, который делает CRISPR, появилась возможность очень просто и эффективно заменять фрагменты в геноме — вносить строго определенные мутации и чинить сломанные гены. Но есть проблема: репарация чаще всего проходит по не гомологичному пути. Существуют разные методы, позволяющие сдвинуть процесс в сторону гомологичной репликации, но пока они работают не очень хорошо.

Технологии редактирования генома существовали и ранее. Но они требовали сборки так называемых кастомных белков — под заказ. Для каждой операции нужно было собирать новый белок. Это занимало несколько недель и даже месяцев. Стоил каждый такой белок несколько тысяч евро. А CRISPR-реагенты стоят 10‒20 евро — в сотни раз меньше. Стало возможным проводить эксперименты гораздо быстрее и в огромных масштабах. Если вам в воскресенье пришла хорошая идея, то через неделю у вас уже будет клеточная линия с готовой мутацией, — и идею можно будет проверить.

Естественно, это подтолкнуло развитие биотехнологий и промышленности. Появились тысячи компаний, которые пытаются коммерциализировать CRISPR. Параллельно идет патентная война между MIT и Университетом Беркли, где работает Дженнифер Даудна.

Применение CRISPR-Cas9

Что можно сделать с помощью CRISPR? Можно сломать, починить, заменить практически любой ген в геноме. Факт: биологи любят ломать гены, чтобы выяснить, как они работают.

Можно сделать хромосомную перестройку. Это очень важно в онкологии, где ряд заболеваний вызывают хромосомные перестройки.

На следующем этапе технологию улучшили, лишив Cas-нуклеазу активности — сделали ее не режущей. Одновременно «пристегнули» к ней другие ферменты. В итоге она просто садится на строго определенный фрагмент ДНК и может его редактировать, не вызывая повреждений. Например, менять азотистые основания без внесения разрывов в ДНК, что очень важно для биомедицинских задач.

Ученые уже научились активировать или репрессировать работу гена — редактировать эпигеном. Известно, что некоторые гены в организме метилированные, кроме того, существуют специальные белки — гистоны, которые связаны с ДНК. Все это определяет, как ведет себя клетка. CRISPR позволяет влиять и на это.

При помощи CRISPR можно производить высокоточную микроскопию участков генома. Это создает огромные возможности для изучения и настоящий взрыв технологий, который до 2012 года невозможно было себе представить.

Редактируем коров, собак и помидоры

Для чего еще используется подобное редактирование? Например, пятна у породы коров сделали из черно-белых серо-белыми. Считается, что так они лучше переносят жару.

Собакам породы бигль добавили мышц. Практический смысл этой, несомненно, большой работы мне неясен. Но работу выполняли китайцы. Возможно, у них свое представление о прекрасном.

Человеческих органов для пересадки всегда не хватает, поэтому пересаживают органы свиней. Но тут есть проблема: у них в геноме присутствует много спящих ретровирусов, которые после пересадки могут активироваться и угрожать здоровью пациента. У свинок на фото эти фрагменты в геноме инактивировали.

Еще пример: с помощью CRISPR отредактировали количество ветвлений на томатной ветке. А также размеры плодов. Все это на фото выше.

Отредактированных растений уже очень много. О масштабах можно судить по количеству публикаций в научных журналах.

Но в магазинах (по крайней мере в Европе) CRISPR-модифицированных продуктов нет. Это связано исключительно с осторожностью регулятора, на мой взгляд, излишней. 

Раньше генетически модифицированные продукты в Европе запрещали, потому что не знали, что произойдет, если эти модифицированные растения попадут в дикую природу. Может быть, если генно-модифицированная кукуруза «ворвется» в леса, там вымрут все березы. Также не знали, как они повлияют на здоровье человека в долгосрочной перспективе, потому что при модификации использовали генетические элементы из других организмов.

CRISPR позволяет вносить мутации, не оставляя следов, поскольку внедряемые РНК и белок в клетке деградируют. От них ничего не остается, сохраняется только сама мутация. Фактически CRISPR делает то же самое, что происходит при селекции. Несмотря на это, суперосторожные регуляторы решили, что разрешать CRISPR пока не стоит.

Я, как ученый, считаю, что нужно разрешать, и тогда нас ждет настоящий взрыв технологического развития. С помощью CRISPR мы сможем решить очень многие проблемы, в том числе связанные с глобальным потеплением.

Например, вывести засухоустойчивые или более продуктивные сорта растений, которые позволят использовать меньше пахотных земель, не применять пестициды или удобрения.

CRISPR в биомедицине

Самый волнующий вопрос — применение CRISPR в биомедицинских исследованиях для улучшения жизни больных людей (а может, и здоровых — в перспективе). Главная сложность тут — в доставке «генетических ножниц» в клетки человека. Допустим, нам нужно починить неработающий ген, который вызывает болезнь. Но чинить его надо в целом органе или даже во всем теле. 

К примеру, мутацию, вызывающую диабет, надо чинить во всей поджелудочной железе. Это непросто, потому что клетки прекрасно себя защищают от вторжения чужеродной ДНК. Поэтому исследователи начали с тех вещей, которые можно из человека вынуть, отредактировать в пробирке, затем размножить и вернуть обратно, — с костного мозга и крови.

Здесь показано, как с помощью CRISPR лечат бета-талассемию и серповидноклеточную анемию. 

Эти болезни вызваны двумя разными мутациями в гене бета-гемоглобина.

Больным бета-талассемией нужны частые переливания крови. У больных серповидноклеточной анемией эритроциты забивают сосуды. Качество жизни у них низкое, и есть риск ранней смерти.

Что в такой ситуации позволяет сделать CRISPR? У человека есть третий ген гемоглобина — фетальный гемоглобин, который активен только у эмбрионов до рождения. После рождения он выключается, работают взрослые альфа- и бета-гемоглобины. CRISPR позволяет включить ген фетального гемоглобина — выключив ген, который его контролирует.

У двух больных женщин забрали клетки костного мозга и при помощи вируса внедрили в них CRISPR-конструкцию, которая инактивировала ген BCL11A. В этих клетках заработал фетальный гемоглобин. Правильно отредактированные, отселектированные и размноженные клетки вернули пациентам обратно — пересадили им их же костный мозг. После этого пациентке с бета-талассемией, которой нужно было в среднем 16 переливаний крови в год, в течение года не понадобилось ни одной процедуры. То же произошло и с больной серповидноклеточной анемией — их реально вылечили.

Эти работы перешли на следующую стадию клинических испытаний — в ближайшее время этот метод может войти в повсеместную практику.

Следующее направление работы — терапия ВИЧ. Есть люди, которые не заражаются вирусом иммунодефицита человека за счет мутации в гене CCR5 — делеции в 32 нуклеотида. Если у человека обе копии гена мутированы, вирус просто не может проникнуть в их клетки.

У части пациентов на фоне ВИЧ развивается лимфобластный лейкоз (рак крови). Если другие методы терапии не помогают, больным лимфобластным лейкозом часто пересаживают костный мозг. В этом случае взяли костный мозг у донора, который подходил для лечения лейкемии.

Перед пересадкой клетки отредактировали с помощью CRISPR, выключив в них ген CCR5, — повторили мутацию, которая существует в природе. Пересадка вылечила пациента и от лейкоза, и от ВИЧ.

На мой взгляд, это одна из самых ярких демонстраций возможностей CRISPR.

CRISPR и этика

Говоря о ВИЧ, нельзя не вспомнить о самом нашумевшем случае использования CRISPR. Это история 2018 года. Виновник событий — Цзянькуй Хэ, китайский ученый, который провел эксперимент с редактированием человеческих эмбрионов.

Он занимается ЭКО. Получив эмбрионы от пар, где отцы были инфицированы ВИЧ, он попытался с помощью CRISPR выключить в них ген CCR5. В результате эксперимента родилось трое внешне здоровых детей.

Однако произошло лишь частичное редактирование. У одной девочки первая копия гена получилась с 15-нуклеотидной делецией, чего оказалось недостаточно, чтобы ген перестал функционировать. А вторая копия гена — без изменений. В итоге никакой защиты девочка не получила. Со второй девочкой получилось лучше, но ген все равно остался частично функциональным.

Проблема этого эксперимента — в нарушении этических норм и законов. Как выяснилось, Цзянькуй Хэ фальсифицировал разрешение этической комиссии, которая не одобрила это исследование. Во всех странах у нормальных ученых это означает полный запрет, но он его проигнорировал. Кроме того, эксперимент был плохо подготовлен, исследователь не взвесил возможные риски. Редактирование толком не получилось, а последствия этих экспериментов могут проявить себя позже. CRISPR не обладает стопроцентной точностью, он может вносить мутации где-то еще в геноме. И где он их внесет, предсказать сложно.

Если бы все дети с ВИЧ умирали, это меняло бы дело. Но с современными препаратами ВИЧ-инфицированные матери рожают ВИЧ-негативных детей более чем в 90% случаев. Поэтому эксперимент был еще и бессмысленный.

Ни один ученый в мире не сомневался, что технически метод CRISPR позволяет редактировать эмбрионы, то есть научной новизны в этом эксперименте тоже не было. Но это надо было делать с соблюдением всех норм и другим уровнем подготовки. А главное, технология еще недостаточно созрела, чтобы со стопроцентной гарантией отредактировать только нужное место в геноме и ничего не сломать в остальных.

Гражданин Хэ подорвал веру в ученых, получив вал критики, почти полмиллиона долларов штрафа и три года лишения свободы. 

Я думаю, до широкой практики редактирования человеческих эмбрионов нам далеко. Но, безусловно, когда-то мы к этому придем, и при помощи CRISPR будут лечить тяжелые наследственные заболевания. 

Кому сейчас доступен CRISPR

Поработать с CRISPR могут «не только лишь все»©. В интернете за небольшие деньги можно купить набор, где есть все необходимое. 

Если у вас есть мало-мальски оборудованная лаборатория для простейших молекулярно-биологических экспериментов, начать работать с CRISPR будет легко. И это действительно фантастический инструмент, который невероятно ускорил прогресс биомедицинской науки. 

Вся эта история учит нас тому, что даже ковыряясь — буквально — в грязи, можно сделать невероятные открытия. Ну и еще тому, что наука интернациональна. 

Нет никакой российской науки, немецкой науки, есть интернациональная наука.

Та же Эммануэль Шарпантье работала сначала в Нью-Йорке, потом в Мемфисе, в Вене, в Швеции, в Ганновере, а прямо сейчас работает в Берлине. Поэтому задача ученого — знать хотя бы один международный язык и пытаться развивать собственную мобильность — двигаться, искать связи и сотрудников, новых коллег. Шарпантье и Даудна встретились на конференции, заинтересовались общей проблемой и в итоге получили Нобелевскую премию. Кто знает, как бы сложилась история CRISPR, не будь этой встречи.

Каждый из живых организмов на Земле носит в клетках наследственный материал своих предков. Эти данные называются геномами, и они нужны непосредственно для создания и поддержания деятельности организма. Генная инженерия работает над изменениями в наследственной информации. Рассказываем, что происходит с редактированием геномов прямо сейчас.

Применение генной инженерии в научных исследованиях

• Нокаут гена

Для изучения функции того или иного гена может быть применён нокаут гена. Так называется техника удаления одного или большего количества генов, что позволяет исследовать последствия подобной мутации.

Для нокаута синтезируют такой же ген или его фрагмент, измененный так, чтобы продукт гена потерял свою функцию. Основные методы реализации: цинковый палец, морфолино и TALEN.

Для получения нокаутных мышей полученную генно-инженерную конструкцию вводят в эмбриональные стволовые клетки, где конструкция подвергается соматической рекомбинации и замещает нормальный ген, а измененные клетки имплантируют в бластоцисту суррогатной матери. У плодовой мушки дрозофилы мутации инициируют в большой популяции, в которой затем ищут потомство с нужной мутацией. Сходным способом получают нокаут у растений и микроорганизмов.

• Искусственная экспрессия

Логичным дополнением нокаута является искусственная экспрессия, то есть добавление в организм гена, которого у него ранее не было. Этот способ генной инженерии также можно использовать для исследования функции генов. В сущности процесс введения дополнительных генов таков же, как и при нокауте, но существующие гены не замещаются и не повреждаются.

• Визуализация продуктов генов

Используется, когда задачей является изучение локализации продукта гена. Одним из способов мечения является замещение нормального гена на слитый с репортерным элементом, например, с геном зеленого флуоресцентного белка GFP. Этот белок, флуоресцирующий в голубом свете, используется для визуализации продукта генной модификации.

Хотя такая техника удобна и полезна, её побочными следствиями может быть частичная или полная потеря функции исследуемого белка. Более изощрённым, хотя и не столь удобным методом является добавление к изучаемому белку не столь больших олигопептидов, которые могут быть обнаружены с помощью специфических антител.

• Исследование механизма экспрессии

В таких экспериментах задачей является изучение условий экспрессии гена. Особенности экспрессии зависят прежде всего от небольшого участка ДНК, расположенного перед кодирующей областью, который называется промотор и служит для связывания факторов транскрипции.

Этот участок вводят в организм, поставив после него вместо собственного гена репортерный, например, GFP или фермента, катализирующего легко обнаруживаемую реакцию. Кроме того, что функционирование промотора в тех или иных тканях в тот или иной момент становится хорошо заметным, такие эксперименты позволяют исследовать структуру промотора, убирая или добавляя к нему фрагменты ДНК, а также искусственно усиливать его функции.

Зачем нужна генная инженерия человека

В применении к человеку генная инженерия могла бы применяться для лечения наследственных болезней. Однако, технически, есть существенная разница между лечением самого пациента и изменением генома его потомков.

Задача изменения генома взрослого человека несколько сложнее, чем выведение новых генноинженерных пород животных, поскольку в данном случае требуется изменить геном многочисленных клеток уже сформировавшегося организма, а не одной лишь яйцеклетки-зародыша. Для этого предлагается использовать вирусные частицы в качестве вектора.

Вирусные частицы способны проникать в значительный процент клеток взрослого человека, встраивая в них свою наследственную информацию; возможно контролируемое размножение вирусных частиц в организме. При этом для уменьшения побочных эффектов учёные стараются избегать внедрения генноинженерных ДНК в клетки половых органов, тем самым избегая воздействия на будущих потомков пациента.

Также стоит отметить значительную критику этой технологии в СМИ: разработка генноинженерных вирусов воспринимается многими как угроза для всего человечества.

С помощью генотерапии в будущем возможно изменение генома человека. В настоящее время эффективные методы изменения генома человека находятся на стадии разработки и испытаний на приматах.

Долгое время генетическая инженерия обезьян сталкивалась с серьёзными трудностями, однако в 2009 году эксперименты увенчались успехом: в журнале Nature появилась публикация об успешном применении генноинженерных вирусных векторов для излечения взрослого самца обезьяны от дальтонизма. В этом же году дал потомство первый генетически модифицированный примат (выращенный из модифицированной яйцеклетки) — обыкновенная игрунка (Callithrix jacchus).

Хотя и в небольшом масштабе, генная инженерия уже используется для того, чтобы дать шанс забеременеть женщинам с некоторыми разновидностями бесплодия. Для этого используют яйцеклетки здоровой женщины. Ребёнок в результате наследует генотип от одного отца и двух матерей.

Однако возможность внесения более значительных изменений в геном человека сталкивается с рядом серьёзных этических проблем. В 2016 в США группа учёных получила одобрение на клинические испытания метода лечения рака с помощью собственных иммунных клеток пациента, подвергаемых генной модификации с применением технологии CRISPR/Cas9.

В конце 2018 года в Китае родились двое детей, геном которых был искусственно изменён (выключен ген CCR5) на стадии эмбриона методом CRISPR/Cas9, в рамках исследований, проводимых с 2016 года по борьбе с ВИЧ. Один из родителей (отец) был ВИЧ-инфицированным, а дети, по заявлению, родились здоровыми.

Поскольку эксперимент был несанкционированным (до этого все подобные эксперименты на человеческом эмбрионе разрешались только на ранних стадиях развития с последующим уничтожением экспериментального материала, то есть без имплантации эмбриона в матку и рождением детей), ответственный за него учёный не предоставил доказательств своим заявлениям, которые были сделаны на международной конференции по редактированию генома.

В конце января 2019 года властями Китая были официально подтверждены факты проведения данного эксперимента. Тем временем учёному было запрещено заниматься научной деятельностью и он был арестован.

Как редактируют человеческий геном?

• Метод «цинковые пальцы»

«Цинковые пальцы» встречаются и в составе человеческих белков. Благодаря этому методу можно сконструировать цепь ZFN так, что она будет узнавать определённый участок ДНК. Это дает возможность точечного воздействия на заданные участки в составе сложных геномов.

Домены «цинковые пальцы» встречаются в составе человеческих факторов транскрипции – белков, регулирующих процесс синтеза РНК с матрицей ДНК. При создании искусственных нуклеаз можно сконструировать цепочку из «цинковых пальцев» так, что она будет узнавать определенный участок ДНК.

Если такая цепочка будет достаточно длинной, она может распознавать относительно протяженные последовательности ДНК, состоящие из ряда тринуклеотидных фрагментов. Это означает реальную возможность точечного воздействия на заданные участки в составе больших сложных геномов.

Однако у метода «цинковых пальцев» обнаружились и серьезные недостатки: во-первых, это не вполне строгое распознавание тринуклеотидных повторов, что приводит к заметному числу расщеплений ДНК в «нецелевых» участках.

Во-вторых, метод оказался весьма трудозатратным и дорогостоящим, поскольку для каждой последовательности ДНК необходимо создать свою оптимизированную белковую структуру zinc-finger нуклеазы. Поэтому система «цинковые пальцы» широкого распространения не получила.

• TALEN

В 2011 году журнал Nature Methods назвал систему TALEN (Transcription Activator-like Effector Nucleases) «методом года» благодаря широкому спектру возможных применений в разных областях фундаментальной и прикладной науки.

TALEN — один из способов направленного внесения разрыва в ДНК с последующим его «залечиванием» — для выключения генов у мышей. Сразу после них эту технологию применили для внесения в мышиный геном мутации, приводящей к развитию одного из наследственных синдромов. Авторам метода моделирования генетически обусловленных болезней удалось не только «испортить» мышиный геном, но и исправить его обратно.

• CRISPR/Cas9

Метод обеспечивает точное воздействие на заданные участки ДНК и может быть использован практически в любой современной молекулярно-биологической лаборатории.

В основе этой системы — особые участки бактериальной ДНК — CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, или короткие палиндромные кластерные повторы). Разделяют эти повторы спейсеры — короткие фрагменты чужеродной ДНК. Последние встраиваются в геном после того, как ДНК рекомбинирует с её геномом.

Примеры редактирования человека

• Редактирование генома прямо в теле

Заболевание 44-летнего жителя Аризоны Брайана Мадо проявилось еще в раннем детстве. Оно неизлечимо и наследуют его в основном мужчины. Мукополисахаридоз II типа — это метаболическое расстройство: у людей с ним есть мутация в гене, ответственном за производство фермента, который участвует в расщеплении сложных углеводов. В итоге они накапливаются в клетках и вызывают многочисленные патологии органов.

Мужчина решил принять участие в клиническом испытании нового метода — генной терапии. Это лишь первая фаза исследования, а всего до регистрации терапии (то есть до разрешения применять этот метод для всех больных с синдромом Хантера) их должно быть три.

Метод, который использовали в случае Брайана Мадо, позволяет редактировать геном прямо в теле человека — и при этом достаточно точно попадать в конкретный участок ДНК. Редактирование происходит с помощью так называемых «цинковых пальцев». 

• Генетически модифицированные дети

Китайский исследователь Хэ Цзянькуй отредактировал геномы человеческих эмбрионов перед процедурой искусственного оплодотворения, в результате чего на свет появились двое детей с измененной ДНК.

С помощью системы CRISPR/Cas9 исследователь отредактировал геномы эмбрионов семи пар во время репродуктивного лечения. В результате одной из беременностей от здоровой матери и ВИЧ-инфицированного отца родились две девочки-двойняшки с измененной ДНК. Хэ Цзянькуй пояснил, что удалил у детей ген CCR5, благодаря чему они получили пожизненный иммунитет к ВИЧ.

• Возвращение зрения с помощью генной терапии

Для восстановления зрения можно использовать оптогенетические технологии, с помощью которых работой нейронов можно управлять с помощью светочувствительных белков бактерий и вспышек лазера.

Руководствуясь этой идеей, биологи создали вирус, который может проникать в ганглионарные нейроны. Эти нервные клетки отвечают за передачу сигналов из сетчатки в мозг человека. Попавший в ганглионарный нейрос вирус заставляет его производить подобные сигнальные молекулы. Однако эта процедура не возвращает зрение сама по себе, так как белки бактерий реагируют на свет не так, как палочки и колбочки сетчатки.

Чтобы решить эту проблему, профессор Базельского университета Ботонд Роска и профессор Питтсбургского университета Хосе Сахель создали специальные очки, которые преобразуют поступающие в них изображение в понятный мозгу формат и стимулируют ганглионарные клетки вспышками лазера. В результате пациент может видеть силуэты крупных предметов и объектов и совершать другие сложные действия

Читать далее:

Ученые проверили теорию панспермии на тихоходках: они могут путешествовать в космосе

Ученые выяснили, что сверхобогащенное золото образуется как простокваша

Крошечный водородный двигатель заменил аналоги на ископаемом топливе

Введение

Актуальность данной работы обусловлена стремительным развитием молекулярной генетики и созданных ею генетических технологий. Расширились возможности генной терапии заболеваний, появились методы редактирования геномов, в том числе генома человека [1, 2]. Современные геномные технологии позволили лечить заболевания, считавшиеся ранее неизлечимыми, способствовали развитию персонализированного подхода к диагностике заболевания и лечению пациента с учетом индивидуальных характеристик его генома [3].

Методы генной инженерии

Генная инженерия позволила создавать определенные геномные конструкции бактерий, но испытывала нехватку методов при работе с геномами высших организмов. Подходы к редактированию генома человека появились лишь в конце прошлого века. С целью обеспечения адресной доставки гена в клетки-мишени стали использовать рекомбинантные носители (векторы), чаще всего сконструированные на основе вирусов, подвергшихся специальной модификации с целью повышения их безопасности для человека. Чаще всего применяются рекомбинантные аденовирусы, ретровирусы, аденоассоциированные вирусы, лентивирусы и ряд других [4–7].

Путем введения модификаций в геном ретровируса, т. е. вставки измененных человеческих генов, можно добиться внедрения в геном хозяина таких элементов. Однако отсутствие специфичности встраивания являлось существенным недостатком. Поэтому находкой стал разработанный в 2012–2013 гг. метод редактирования генома CRISPR/Cas, в основе которого лежит способ защиты бактерий от вирусов-бактериофагов, выражающийся в избирательном расщеплении его ДНК, своеобразный «иммунитет» бактерий [8, 9]. В 2020 г. Д. Дудна и Э. Шарпантье за разработку данного метода в применении к клеткам человека удостоены Нобелевской премии по химии. Сначала на бактерии Streptococcus pyogenes они установили, как работает белок Cas9, а позднее показали, что с помощью этого механизма можно разрезать в адресной точке любую молекулу ДНК, в том числе и ДНК человека [8].

Создание системы CRISPR/Cas немедленно явилось мощным стимулом ее использования в России. Внедрение новой технологии произвело революцию в области генетической терапии, поскольку она позволяет намного более точно редактировать ген, чем ранее описанные инструменты, проверить ее на животных моделях и вплотную подступить к лечению генетических заболеваний у людей [7]. В настоящее время подробно описан механизм CRISPR/Cas9, включая его биохимические и структурные последствия, выделены последние улучшения в системе CRISPR/Cas9, особенно модификации белка Cas9 для настройки, рассмотрены современные приложения, в которых использовалась универсальная система CRISPR/Cas9 для редактирования генома, эпигенома или РНК различных организмов [3, 9]. С помощью CRISPR/Cas можно вносить точечные мутации, встраивать в определенные места новые гены или, наоборот, удалять участки нуклеотидных последовательностей, исправлять или заменять фрагменты генов. В современных обзорах представлено изучение технических аспектов, областей применения и перспектив этой технологии в различных областях [3, 7, 9].

Другие способы модификаций генома связаны с технологиями ZFN и TALEN [1], основанными на природных свойствах определенных белков, называемых нуклеазами. Эти ферменты умеют проводить специфическое вырезание участка исходного генома и встраивание в место разреза привнесенного с собой фрагмента исправленной ДНК. Такой способ позволяет проводить целевую модификацию нарушенных генов, гораздо более точную, чем просто ретровирусная. Отличие ZFN и TALEN заключается в использовании разных видов ферментов, но итог их работы примерно одинаков. ZFN и TALEN не нашли массового применения в медицине, прежде всего из-за трудоемкости метода. Для редактирования же генома с помощью системы CRISPR/Cas9 используется единственный белок Cas9, вносящий разрыв в ДНК, а РНК-гид, узнающую мишень на простом принципе комплементарного узнавания нуклеиновых кислот, можно создать за короткое время. Это новый уровень редактирования, более дешевый и точный. В первую очередь с помощью CRISPR/Cas9 можно лечить моногенные генетические заболевания: гемофилию, муковисцидоз, лейкемию. В этих случаях понятно, какие именно гены нужно отредактировать, но существуют заболевания с высокой наследуемостью, генетическая природа которых очень сложна. Такие многофакторные болезни — сложный результат взаимодействия разных генов и их вариантов, для лечения потребуются комплексные подходы [10].

Разделяют два способа воздействия генных конструкций на клетки-мишени — in vivo и ex vivo [11]. В первом случае — непосредственно на тканях живого организма с использованием адресной доставки нуклеиновых кислот и преодолением сложных проблем, связанных с быстрой деградацией чужеродного биологического материала. Во втором случае воздействие основано на генотерапевтической модификации вне организма стволовых клеток, клеток крови, костного мозга и др. с последующим их возвратом в системный кровоток или пораженный орган. Используя систему CRISPR/Cas9, можно было бы получить образец костного мозга пациента и вылечить его собственные кроветворные стволовые клетки и затем ввести их в организм, предварительно устранив с помощью облучения собственные пораженные кроветворные клетки. Они начнут делиться и производить здоровые кровяные клетки. Если же речь идет о редактировании, например, генов клеток опухоли печени, все гораздо сложнее. Нужно будет решить проблему доставки компонентов CRISPR/Cas9-системы именно к пораженным клеткам. Хотя многие исследования показали, что технология CRISPR/Cas9 является более эффективной, специфичной и управляемой, чем предыдущие поколения инструментов редактирования генов, ее можно еще улучшить, повысив ее общую эффективность при более высокой частоте модификаций генома и уменьшив ее нецелевые эффекты. Уже рассматривается развитие технологии CRISPR/Cas9 с особым вниманием к повышению специфичности его последовательности, уменьшению нецелевых эффектов и систем доставки [12]. В данном обзоре представлены примеры недавнего успешного применения технологии CRISPR/Cas9 в лабораторных и клинических исследованиях.

Открытие возможности перепрограммирования зрелых клеток человека и разработка инженерных эндонуклеаз для улучшения редактирования генома являются двумя наиболее впечатляющими и эффективными технологическими достижениями в современной медицине и науке [13]. У индуцированных плюрипотентных стволовых клетках человека (ИПСК) есть потенциал для создания новых модельных систем для изучения биологии развития человека, механизмов заболеваний и тестирования лекарственных препаратов. Коррекция генов в специфических для пациента ИПСК может стать новым источником для заместительной клеточной терапии [14]. Инструменты редактирования генома уже произвели революцию в биомедицинских исследованиях, в настоящее время ожидается их применение в клинике. Тем не менее широкое использование данных методов в исследованиях выявило большую непредсказуемость эффектов, необходимость обширной проверки моделей, молекулярного обоснования соотношения риска и пользы. Проблемы эти широко обсуждаются [15].

Другие наиболее часто применяемые методы генной терапии — использование антисмысловых нуклеотидов как в эксперименте, так и в клинике, метод генного «глушения», или генный сайленсинг, метод выключения генов, основанный на РНК-интерференции, использование для модуляции экспрессии генов микроРНК [16, 17]. Развивается применение оптогенетической геномной инженерии для создания животных моделей, в частности для получения генетически модифицированных мышей для биомедицинских исследований [18]. Высокоэффективная технология обеспечивает эффективную рекомбинацию ДНК, которая активируется при освещении синим светом с пространственно-временной точностью. Создана фотоактивируемая модель мыши с нокаутированной рекомбиназой Cre-loxP (мыши TRE-PA-Cre) с использованием системы CRISPR/Cas9. Модель обещает быть полезной для оптогенетической инженерии генома неинвазивным и специфичным для типа клеток методом in vivo. Особое место среди методов генной терапии занимает ДНК-вакцинация, по сравнению с традиционными вакцинами она дает возможность индукции как гуморального, так и клеточного иммунного ответа, отличается низкой эффективной дозой, а также отсутствием вирулентности, простотой и быстротой получения высоких доз вакцины, высокой устойчивостью и удобством хранения [2].

Применение технологий в клинической практике

Нейромышечные заболевания

Удалось показать, что внутривенная генная терапия с помощью вектора AAV9 может остановить спинальную мышечную атрофию 1 типа (SMA1) — прогрессирующее моногенное заболевание двигательных нейронов, которое возникает в младенчестве, что приводит к неспособности к движению и смерти или необходимости искусственной вентиляции легких в возрасте до 2 лет. Ученым удалось осуществить функциональную замену мутантного гена фактора выживаемости мотонейронов-1 (SMN1). В ноябре 2017 г. межнациональная группа специалистов и компания AveXis сообщили о том, что однократное внутривенное введение аденоассоциированного вирусного вектора, содержащего ДНК, кодирующую SMN, пациентам с SMA1 обусловило более длительное выживание и лучшую моторную функцию, чем в контрольных когортах [19].

Крупным прорывом в области генной терапии стало сообщение о том, что ученые-клиницисты сохранили жизнь девочке, родившейся с фатальным наследственным нейромышечным заболеванием SMA1, путем введения отсутствующего гена в ее спинальные нейроны. В 8 нед. она прошла курс генной терапии, который дал ее организму критически недостающий белок. Результаты испытания, в котором участвовала маленькая пациентка, явились одним из самых впечатляющих успехов в некогда проблемной области, поскольку исследователи впервые провели новый ген через гематоэнцефалический барьер [20]. Успешный клинический исход эксперимента позволил надеяться на применение генной терапии в лечении других нейрозаболеваний путем доставки генов в таргетные клетки с помощью векторов на основе аденоассоциированного вируса.

Мышечная дистрофия Дюшенна является одним из наиболее распространенных наследственных генетических заболеваний и вызвана мутациями в гене DMD, который кодирует белок дистрофин. Недавние успехи в редактировании генома и генной терапии дают надежду на развитие потенциальной терапии. Укороченные версии гена DMD могут доставляться в пораженные ткани с вирусными векторами и уже продемонстрировали многообещающие результаты на различных моделях животных. Редактирование генома с помощью системы CRISPR/Cas9 было использовано для восстановления экспрессии дистрофина путем делеций одного или нескольких экзонов гена DMD в клетках пациента и на мышиной модели. Более подробно применяемые технологии и их развитие рассмотрены в обзорах, где представлены последние достижения и перспективы по трем основным подгруппам терапии дистрофии Дюшенна, включая генную терапию, клеточную терапию и фармакологическую терапию [21–23].

Онкологические заболевания

Опухоли остаются проблемой для здоровья во всем мире, и генная терапия является серьезным подходом к их лечению. В онкологии легкость и универсальность CRISPR/Cas9 позволили идентифицировать новые гены-мишени  и раскрыть некоторые механизмы устойчивости к терапии [24]. До сих пор большинство исследований проводилось на опухолях у взрослых. В последние годы технология CRISPR/Cas9 применяется в лечении редких детских злокачественных новообразований, сарком мягких тканей, в отношении которых этот подход представляется многообещающим [25]. Достигнуты успехи генной терапии в лечении отдельных видов рака [26–28], появились новые подходы к поиску критически важных генов в раковом геноме [29]. Саркомы относятся к наиболее агрессивным опухолям и обычно плохо реагируют на химиотерапию. В последние годы было показано, что специфическое слияние / мутации генов или избыточная экспрессия/активация генов участвуют в патогенезе развития саркомы. РНК-направляемая нуклеаза CRISPR/Cas9 является удобной и универсальной платформой для сайт-специфического редактирования генома и эпигеном-направленной модуляции. В настоящее время обсуждаются механизмы применения редактирования генома в случае саркомы, будущие направления исследований и проблемы, с которыми сталкиваются при реализации этих подходов [30]. Подход ex vivo к редактированию очень эффективен для многих болезненных состояний, включая рак и серповидноклеточную анемию, но в идеале редактирование генома также следует применять к заболеваниям, которые требуют модификации клеток in vivo. Однако использование технологий CRISPR in vivo может быть затруднено такими проблемами, как нецелевое редактирование, неэффективная или нецелевая доставка и стимуляция контрпродуктивных иммунных реакций. Исследования, направленные на решение этих проблем, могут заложить научную основу клинических испытаний с участием ZFN, TALEN и редактирования генома на основе CRISPR с учетом известных ограничений использования CRISPR у людей [31].

Иммунологические расстройства

Хроническая гранулематозная болезнь (ХГБ) является редким наследственным заболеванием фагоцитарных клеток. Имеются сообщения о первоначальных результатах, полученных у 9 пациентов с тяжелой формой ХГБ, которые получали ex vivo аутологичную генную терапию на основе CD34 и гемопоэтических стволовых клеток. Выжившие пациенты не имели новых инфекций, связанных с ХГБ, и 6 человек смогли прекратить антибиотикопрофилактику. Первичная цель была достигнута у 6 из 9 пациентов через 12 мес. наблюдения, что позволило считать ауто-
логичную генную терапию перспективным подходом для пациентов с ХГБ [32].

Атаксия-телеангиэктазия (AT) и синдром Айкарди — Гутьерес (САГ) являются наследственными нарушениями иммунитета с преобладающим неврологическим фенотипом. Доступные методы лечения лишь частично эффективны, прогноз при их применении неблагоприятный. ИПСК получают путем перепрограммирования соматических клеток пациента, сохраняя индивидуальное генетическое наследие донора и создавая модели заболевания конкретного пациента, полезные для исследования патогенеза, эффектов лекарств и разработки методов лечения. Исследовали цитотоксичность панели иммуномодуляторов с использованием ИПСК пациентов с AT или различными формами САГ [34]. Цитотоксические эффекты двух препаратов, предложенных для лечения соответственно AT и САГ (дексаметазон и мепакрин), были оценены после 72-часового воздействия. Данные были получены также для других иммуномодулирующих препаратов (тиогуанин, меркаптопурин, талидомид и леналидомид). Была проанализирована относительная экспрессия генов, участвующих в тестируемых лекарственных путях, и предложена инновационная модель in vitro, полезная для исследования механизмов лекарственных средств, потенциально эффективных при вышеуказанных заболеваниях [34].

Заболевания органов зрения и слуха

В последнее время генная терапия рассматривается как потенциально эффективное средство лечения заболеваний дегенерации сетчатки. Система CRISPR/Cas9 и ее комбинации с плюрипотентными стволовыми клетками уже используются в качестве мощного инструмента редактирования генома в офтальмологических исследованиях с учетом ее преимуществ и проблем [35]. Очерчены клинические пути для лечения наследственных заболеваний глаз на основе CRISPR и дан обзор важных этических последствий редактирования генов [36].

Примером может служить изучение ретинопатии у недоношенных детей [37]. Длинная некодирующая РНК (lncRNA) регулирует пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток сетчатки человека, а также неоваскуляризацию сетчатки при диабетической ретинопатии. Основываясь на сходстве патогенезов ретинопатии у недоношенных детей и диабетической ретинопатии, сделали вывод о сходной роли lncRNA в патогенезе двух видов ретинопатии и разработали модель на животных (мыши) для изучения патогенеза у детей. Установили, что различно экспрессируемые lncRNA могут регулировать патогенез ретинопатии у мышей через микроРНК и множественные сигнальные пути, и предложили потенциальные терапевтические мишени для генной терапии.

Потеря слуха является одним из наиболее распространенных сенсорных расстройств, затрагивающих примерно 1 из 500 новорожденных без лечения. Мутации генов внутреннего уха способствуют большей части генетической глухоты. С технологией CRISPR/Cas9 функции генов внутреннего уха могут быть эффективно изучены путем нарушения нормальных аллелей гена. Что касается генетической потери слуха, то CRISPR/Cas9 может восстанавливать измененные мутациями гены с помощью гомологичной репарации. Показали, что CRISPR/Cas9-опосредованное редактирование генома может эффективно выполняться во внутреннем ухе млекопитающих in vivo. В настоящее время обсуждаются вопросы, касающиеся применения CRISPR/Cas9 в слуховых системах, связанных с генетической потерей слуха у человека [38].

Синдром Ашера является частой причиной потери слуха и зрения у людей. Были определены три клинических подтипа, на данный момент идентифицировано 10 генов USH. Охарактеризованы несколько моделей мышей Usher, которые точно воспроизводят слуховой фенотип, связанный с синдромом Ашера, и вестибулярный фенотип, связанный с некоторыми мутациями в генах USH. За последние 10 лет появились новые методы лечения синдрома Ашера, основанные на недавнем прогрессе в передаче генов и новых инструментах редактирования генов [39]. Многообещающий успех, демонстрирующий восстановление функций слуха и равновесия, достигнут с помощью различных терапевтических стратегий на моделях животных. Однако перенос метода в клинику требует его дальнейших улучшений.

Гематологические заболевания

Гемоглобинопатии — это группа наследственных заболеваний, обусловленных генетическими нарушениями, приводящими к абберантной экспрессии гемоглобина или изменениям его структуры, что приводит к тяжелым нарушениям здоровья и смерти. Серповидноклеточная анемия и β-талассемия, наиболее распространенные формы гемоглобинопатий, обычно лечатся с помощью переливаний и фармакологических препаратов. Современная терапия гемоглобинопатий основана на трансплантации аллогенных стволовых клеток от здоровых доноров, однако она может применяться только у ограниченного числа пациентов. Новым лечебным подходом является коррекция генов с помощью нуклеазы, которая включает применение инструментов точного редактирования генома для исправления вызывающей болезнь мутации. В настоящее время представлены приложения для инженерии генома с использованием CRISPR/Cas9 и рассмотрены проблемы и перспективы применения системы CRISPR/Cas9 в качестве варианта лечения серповидноклеточной анемии [40].

Гемофилия вызывается различными мутациями в генах фактора свертывания крови, включая фактор VIII (FVIII) и фактор IX (FIX), которые кодируют ключевые белки в пути свертывания крови. Выходя за рамки культивируемых клеточных систем, исследователи сейчас вступают в эпоху прямой генной коррекции in vivo с использованием различных инструментов доставки. Уже описано текущее состояние технологии редактирования генома in vivo и ex vivo, связанной с возможной коррекцией гена гемофилии, и важные вопросы, связанные с применением технологии редактирования генов гемопоэтических стволовых клеток у пациентов с гематологическими заболеваниями [41–43].

Другие наследственные заболевания

Муковисцидоз — хроническое прогрессирующее аутосомно-рецессивное заболевание, связанное с нарушением функций секреторных эпителиальных клеток и приводящее, в частности, к обструкции дыхательных путей и протоков поджелудочной железы. Установлено, что болезнь вызывается мутацией в гене CFTR, что позволило бороться с фатальным исходом заболевания. В настоящее время обсуждаются возможности использования технологий геномного редактирования применительно к лечению муковисцидоза. Установлено, что именно система CRISPR/Cas9 смогла обеспечить более простой, быстрый и доступный по цене метод редактирования, чем применение ранее открытых нуклеаз ZFN и TALLEN [44].

Успешной оказалась попытка применения генотерапии в лечении буллезного эпидермолиза, проявляющегося при повреждении гена LAMB3 образованием пузырей и эрозий кожи при любом незначительном воздействии. Ребенку с тяжелой формой заболевания успешно трансплантировали трансгенный эпидермис. Его получали, выращивая культуры клеток эпидермиса пациента и обрабатывая их ретровирусами, несущими нормальную копию LAMB3. Опыт оказался успешным, прежних симптомов не наблюдается в течение 2 лет [45]. В последние годы предприняты попытки изучения с помощью генной терапии нейродегенеративных заболеваний — болезни Паркинсона и болезни Альцгеймера [46, 47].

Заключение

Следует отметить, что хотя система CRISPR/Cas9 обеспечивает удобное редактирование генома, сопровождаемое многими преимуществами, она поднимает существенные этические проблемы. В Китае уже сделаны первые шаги в клинических испытаниях технологий редактирования генома, основанных на CRISPR/Cas9. Использовали эмбрионы человека с мутантным геном, приводящим к β-талассемии. В результате эксперимента в 5–10% эмбрионов мутация, ответственная за возникновение болезни у взрослых людей, действительно была исправлена. Однако во всех клетках редактируемых эмбрионов возникло большое количество незапланированных и, возможно, опасных мутаций. Очевидно, что технология нуждается в значительной доработке, прежде всего в улучшении специфичности белка Cas9. Несмотря на интерес к проблеме, два главных научных журнала — Nature и Science отказались публиковать результаты китайских ученых. Возникло множество этических вопросов, которые пока так и не получили единого решения в мире по поводу того, когда же можно, а когда нельзя применять редактирование генома. Пока каждая из стран решает это по-своему. Так, в Великобритании официально разрешены первые опыты по геномному редактированию эмбрионов человека. В Китае запрещено использование преимплантационной генетической диагностики для выбора пола будущего ребенка, но такая процедура не запрещена в США. Несомненно, исследования в этом направлении будут продолжаться, а правовые нормы — разрабатываться. В России генетическим технологиям уделено особое внимание в рамках национальных проектов.

Известно, что в молекуле ДНК человека содержится информация о последовательности (структуре) аминокислот и белков, которая является генетической программой развития и функционирования организма. Раз это информация, то её можно изменить с помощью воздействия другой информации.

Оказывается психика человека, используя головной мозг в качестве исполнителя, способна на это. Сегодня уже есть средства, позволяющие изменить генетическую программу. Из опыта собственной многолетней практики в области системной онкопсихотерапии могу сказать, что только человек, обладая возможностями сосредоточения сознания и способностью словесного отражения реальности, способен изменить свой генетический код даже при жизни. Подтверждение своим наблюдениям я нахожу в открытиях ученых других стран.

Например, в конце 80-х годов прошлого века американский генетик Брюс Липтон сделал величайшее открытие по поводу влияния мысли на состояние здоровья человека. И в этом нет никакой мистики. Более того, его исследования показали, что направленное психическое воздействие, действительно, способно изменить генетический код человека.

Сегодня уже немало ученых по всему миру сходятся во мнении о тесной взаимосвязи психики и состояния организма человека. Но ведь важно не только понимать, что такая взаимосвязь существует, а еще и «научить» организм естественной саморегуляции и здоровому функционированию.

Такая возможность появляется у человека только в процессе системной коррекции психики с помощью определенных методик и упражнений, позволяющих радикально изменить мировоззрение. Мировоззрение, являясь, своего рода, информационной программой, изменяет гомеостаз, который, в свою очередь, отвечает за саморегуляцию и динамическое равновесие всего организма человека. В результате через некоторый непродолжительный период времени происходит положительная генетическая мутация и организм начинает функционировать, как здоровый. 

Будьте здоровы!

Автор статьи доктор психологии, системный психолог, онкопсихолог Влад Светоч

Почитайте еще статьи из нашего блога

• Возникновение рака. Информационный психоз, как главный источник раковых заболеваний. 

• Рак – это психосоматическое заболевание?

• Мне поставили диагноз рак. Что делать?

• Устранение причин рака и освобождение от болезни

• Рак. Психологические корни болезни.

• Лекарство от рака уже найдено!?
• Вот в чем секрет исцеления от рака…