Если днк полимераза ошибается при образовании пары оснований то такая ошибка

Билет
1
Занятие
6

1. Какие
   белки образуют октамерный комплекс
   с ДНК, называемый нуклеосомой?

   1. Гистоны

   2. Белки
      спираль-поворот-спираль

   3. Белки «лейциновой
      молнии»

   4. Белки типа
      цинковых пальцев

2. Все
   перечисленное является компонентами
   хроматина, кроме:

   1. Белок

   2. РНК

   3. Углевод

   4. ДНК

3. Особо
   конденсированная форма ДНК, из клеток
   высших эукариот называется:

   1. Гетерохроматин

   2. Эухроматин

   3. Недоступная
      для транскрипции

   4. Способная
      связывать РНК-полимеразу

4. Репрессия
   генов гетерохроматина не обеспечивается:

   1. Пространственной
      укладкой ДНК

   2. Метилированием
      дезоксицитидина

   3. Связыванием с
      гистонами и образованием нуклеосом

   4. Группой
      негистоновых HMG
      белков

Билет
2
Занятие
6

1. Ферменты
   топоизомеразы важны в репликации
   ДНК, так как они:

   1. Раскалывают
      фрагменты Оказаки

   2. Ослабляют
      спирализацию ДНК

   3. Понижают
      количество белков-гистонов

   4. Синтезируют
      первый фрагмент РНК

2. Функцию
   раскручивания двойной спирали ДНК в
   репликационной вилке у E.
   coli
   выполняет:

   1. Хеликаза

   2. Праймаза

   3. Рестриктаза

   4. SSB-белки

3. Выберите ферменты
   репликации, участвующие в образовании
   3’, 5’-фосфодиэфирной связи:

   1. ДНК-хеликаза

   2. ДНК-лигаза

   3. ДНК-топоизомераза
      I

   4. ДНК-топоизомераза
      II

4. Укажите фермент,
   который релаксирует как (+), так и (-)
   сверхвитки у эукариот:

   1. Топоизомераза
      I

   2. Топоизомераза
      II

   3. ДНК-праймаза

   4. Полимераза
      

Билет
3
Занятие
6

1. Что не входит в
   состав репликативного комплекса E.
   coli?

   1. Лидирующая цепь

   2. Запаздывающая
      цепь

   3. РНК-полимеразы
      I,
      III

   4. Праймаза

   5. SSB-белок

   6. Теломераза

2. Какая
   из ДНК-полимераз может инициировать
   образование дочерних цепей ДНК у
   эукариот:

   1. ДНК-полимераза
      

   2. ДНК-полимераза
      

   3. ДНК-полимераза
      

   4. ДНК-полимераза
      

3. Та
   дочерняя цепь, которая синтезируется
   с перерывами, называется:

   1. Затравочная
      цепь (праймерная)

   2. Отстающая цепь
      (запаздывающая)

   3. Теломера

   4. Ведущая цепь
      (лидирующая)

4. Короткие
   цепи ДНК, связанные с РНК-праймерами
   на запаздывающей цепи называются:

   1. Фрагментами
      Оказаки

   2. Репликонами

   3. Нулевой
      суперспиралью

   4. Промотором

Билет
4
Занятие
6

1. Укажите
   фермент, который использует энергию
   гидролиза АТФ для расплетание двойной
   спирали ДНК:

   1. ДНК-хеликаза

   2. ДНК-праймаза

   3. ДНК-полимераза

   4. ДНК-топоизомераза
      I

2. Какой
   фермент разрывает и сшивает заново
   цепи ДНК, не используя энергию АТФ?

   1. ДНК-топоизомераза
      I

   2. Хеликаза

   3. ДНК-лигаза

   4. Теломераза

3. Белки,
   связывающиеся с одноцепочечной ДНК
   в репликативной вилке:

   1. SSB-белки

   2. Н₁
      гистон

   3. Гистон октамер

   4. Кислые белки

4. Ферменты,
   ответственные за синтез ДНК как при
   репликации, так и при репарации у
   эукариот называется:

   1. ДНК-полимераза
      

   2. ДНК-полимераза
      

   3. ДНК-полимераза
      

   4. ДНК-лигаза

Билет
5
Занятие
6

1. Активный
   участок хромосомы, учавствующий в
   репликации, представляет собой
   Y-образную
   структуру называемую:

   1. Репликативная
      вилка

   2. Прайсосома

   3. Репликон

   4. Оридижин

2. У
   E.coli
   новосинтезированная ДНК длиной
   1000-2000 нуклеотидов, называется:

   1. Фрагменты
      Оказаки

   2. Ведущая цепь

   3. Отстающая цепь

   4. Праймер

3. Фермент,
   который сшивает разрывы в ДНК, во
   время синтеза ДНК или ее репарации
   называется:

   1. ДНК-N-гликозидаза

   2. ДНК-лигаза

   3. ДНК-эндонуклеаза

   4. Инсертаза

4. Та
   дочерняя цепь ДНК, которая при
   репликации синтезируется непрерывно,
   называется:

   1. Ведущая цепь
      (лидирующая)

   2. Отстающая цепь
      (запаздывающая)

   3. Затравочная
      цепь (праймерная)

   4. Фрагменты
      Оказаки

Билет
6
Занятие
6

1. Если
   ДНК-полимераза ошибается при образовании
   пары оснований, то ошибка исправляется
   специальной системой:

   1. Репликационный
      комплекс

   2. «Обратимые
      нуклеазы»

   3. Топоизомеразы
      I,
      II, III

   4. Репарация

2. Какой
   из ферментов узнает в ДНК дезаминированные
   основания и катализирует их
   гидролитическое отщепление
   дезоксирибозы:

   1. АП-эндонуклеаза

   2. ДНК-гликозидаза

   3. ДНК-полимераза
      

   4. ДНК-лигаза

3. Поставьте
   в правильной последовательности
   события, происходящие при репарации:

   1. Соединение
      неповрежденного и вновь синтезированного
      участка ДНК

   2. Удаление
      поврежденного участка

   3. Определение
      места повреждения

   4. Достройка
      поврежденной цепи

4. Депуринизация
   ДНК обнаруживается и удаляется:

   1. ДНК-N-гликозидазами

   2. ДНК-инсертазой

   3. ДНК-полимеразой
      

   4. ДНК-лигазой

Билет
7
Занятие
6

1. Выберите
   типы повреждений, которые устраняются
   ферментами репарации ДНК:

   1. Дезаминированные
      нуклеотиды

   2. Димеры тимина

   3. Комплементарная
      пара поврежденных нуклеотидов

   4. Продукты
      депуринизации нуклеотидов

2. Укажите
   виды ферментативной активности У ДНК
   полимеразы :

   1. Эндонуклеазная

   2. Экзонуклеазная

   3. Полимеразная

   4. Праймазная

3. Укажите
   какими видами ферментативной активности
   обладает ДНК-полимераза β:

   1. Эндонулеазная

   2. Экзонуклеазная

   3. Полимеразная

   4. Праймазная

4. Дефекты
   в репарационной системе приводят к:

   1. Пигментная
      ксеродерма

   2. Сахарный диабет

   3. Подагра

   4. Синдром
      Леша-Нихена

Билет
8
Занятие
6

1. Какие
   белки образуют октамерный комплекс
   с ДНК, называемый нуклеосомой?

   1. Гистоны

   2. Белки
      спираль-поворот-спираль

   3. Белки «лейциновой
      молнии»

   4. Белки типа
      цинковых пальцев

2. Все
   перечисленное является компонентами
   хроматина, кроме:

   1. Белок

   2. РНК

   3. Углевод

   4. ДНК

3. Особо
   конденсированная форма ДНК, из клеток
   высших эукариот называется:

   1. Гетерохроматин

   2. Эухроматин

   3. Недоступная
      для транскрипции

   4. Способная
      связывать РНК-полимеразу

4. Репрессия
   генов гетерохроматина не обеспечивается:

   1. Пространственной
      укладкой ДНК

   2. Метилированием
      дезоксицитидина

   3. Связыванием с
      гистонами и образованием нуклеосом

   4. Группой
      негистоновых HMG
      белков

Билет
9
Занятие
6

1. Ферменты
   топоизомеразы важны в репликации
   ДНК, так как они:

   1. Раскалывают
      фрагменты Оказаки

   2. Ослабляют
      спирализацию ДНК

   3. Понижают
      количество белков-гистонов

   4. Синтезируют
      первый фрагмент РНК

2. Функцию
   раскручивания двойной спирали ДНК в
   репликационной вилке у E.
   coli
   выполняет:

   1. Хеликаза

   2. Праймаза

   3. Рестриктаза

   4. SSB-белки

3. Выберите ферменты
   репликации, участвующие в образовании
   3’, 5’-фосфодиэфирной связи:

   1. ДНК-хеликаза

   2. ДНК-лигаза

   3. ДНК-топоизомераза
      I

   4. ДНК-топоизомераза
      II

4. Укажите фермент,
   который релаксирует как (+), так и (-)
   сверхвитки у эукариот:

   1. Топоизомераза
      I

   2. Топоизомераза
      II

   3. ДНК-праймаза

   4. Полимераза
      

Билет
10
Занятие
6

1. Что не входит в
   состав репликативного комплекса E.
   coli?

   1. Лидирующая цепь

   2. Запаздывающая
      цепь

   3. РНК-полимеразы
      I,
      III

   4. Праймаза

   5. SSB-белок

   6. Теломераза

2. Какая
   из ДНК-полимераз может инициировать
   образование дочерних цепей ДНК у
   эукариот:

   1. ДНК-полимераза
      

   2. ДНК-полимераза
      

   3. ДНК-полимераза
      

   4. ДНК-полимераза
      

3. Та
   дочерняя цепь, которая синтезируется
   с перерывами, называется:

   1. Затравочная
      цепь (праймерная)

   2. Отстающая цепь
      (запаздывающая)

   3. Теломера

   4. Ведущая цепь
      (лидирующая)

4. Короткие
   цепи ДНК, связанные с РНК-праймерами
   на запаздывающей цепи называются:

   1. Фрагментами
      Оказаки

   2. Репликонами

   3. Нулевой
      суперспиралью

   4. Промотором

Билет
11
Занятие
6

1. Укажите
   фермент, который использует энергию
   гидролиза АТФ для расплетание двойной
   спирали ДНК:

   1. ДНК-хеликаза

   2. ДНК-праймаза

   3. ДНК-полимераза

   4. ДНК-топоизомераза
      I

2. Какой
   фермент разрывает и сшивает заново
   цепи ДНК, не используя энергию АТФ?

   1. ДНК-топоизомераза
      I

   2. Хеликаза

   3. ДНК-лигаза

   4. Теломераза

3. Белки,
   связывающиеся с одноцепочечной ДНК
   в репликативной вилке:

   1. SSB-белки

   2. Н₁
      гистон

   3. Гистон октамер

   4. Кислые белки

4. Ферменты,
   ответственные за синтез ДНК как при
   репликации, так и при репарации у
   эукариот называется:

   1. ДНК-полимераза
      

   2. ДНК-полимераза
      

   3. ДНК-полимераза
      

   4. ДНК-лигаза

Билет
12
Занятие
6

1. Активный
   участок хромосомы, учавствующий в
   репликации, представляет собой
   Y-образную
   структуру называемую:

   1. Репликативная
      вилка

   2. Прайсосома

   3. Репликон

   4. Оридижин

2. У
   E.coli
   новосинтезированная ДНК длиной
   1000-2000 нуклеотидов, называется:

   1. Фрагменты
      Оказаки

   2. Ведущая цепь

   3. Отстающая цепь

   4. Праймер

3. Фермент,
   который сшивает разрывы в ДНК, во
   время синтеза ДНК или ее репарации
   называется:

   1. ДНК-N-гликозидаза

   2. ДНК-лигаза

   3. ДНК-эндонуклеаза

   4. Инсертаза

4. Та
   дочерняя цепь ДНК, которая при
   репликации синтезируется непрерывно,
   называется:

   1. Ведущая цепь
      (лидирующая)

   2. Отстающая цепь
      (запаздывающая)

   3. Затравочная
      цепь (праймерная)

   4. Фрагменты
      Оказаки

Билет
13
Занятие
6

1. Если
   ДНК-полимераза ошибается при образовании
   пары оснований, то ошибка исправляется
   специальной системой:

   1. Репликационный
      комплекс

   2. «Обратимые
      нуклеазы»

   3. Топоизомеразы
      I,
      II, III

   4. Репарация

2. Какой
   из ферментов узнает в ДНК дезаминированные
   основания и катализирует их
   гидролитическое отщепление
   дезоксирибозы:

   1. АП-эндонуклеаза

   2. ДНК-гликозидаза

   3. ДНК-полимераза
      

   4. ДНК-лигаза

3. Поставьте
   в правильной последовательности
   события, происходящие при репарации:

   1. Соединение
      неповрежденного и вновь синтезированного
      участка ДНК

   2. Удаление
      поврежденного участка

   3. Определение
      места повреждения

   4. Достройка
      поврежденной цепи

4. Депуринизация
   ДНК обнаруживается и удаляется:

   1. ДНК-N-гликозидазами

   2. ДНК-инсертазой

   3. ДНК-полимеразой
      

   4. ДНК-лигазой

Билет
14
Занятие
6

1. Выберите
   типы повреждений, которые устраняются
   ферментами репарации ДНК:

   1. Дезаминированные
      нуклеотиды

   2. Димеры тимина

   3. Комплементарная
      пара поврежденных нуклеотидов

   4. Продукты
      депуринизации нуклеотидов

2. Укажите
   виды ферментативной активности У ДНК
   полимеразы :

   1. Эндонуклеазная

   2. Экзонуклеазная

   3. Полимеразная

   4. Праймазная

3. Укажите
   какими видами ферментативной активности
   обладает ДНК-полимераза β:

   1. Эндонулеазная

   2. Экзонуклеазная

   3. Полимеразная

   4. Праймазная

4. Дефекты
   в репарационной системе приводят к:

   1. Пигментная
      ксеродерма

   2. Сахарный диабет

   3. Подагра

   4. Синдром
      Леша-Нихена

Макеты страниц

Та дочерняя цепь ДНК, которая при репликации сннзезируегся непрерывно, называется , а та цепь, которая синтезируется с перерывами, Е. Для ДНК-полимеразы в отличие от РНК-полимеразы совершенно необходим свободный 3′-ОН-конец , спаренной с расплетенной ДНК, чтобы присоединять к нему новые нуклеотиды. Ж. Если ДНК-полимераза ошибочно присоединит неправильный нуклеотид к Зчконцу, ее отдельный каталитически активный домен, обладающий (3′- 5′)- активностью, удалит неподходящее основание. 3, Для инициации синтеза ДНК на отстающей цепи нужны короткие праймеры, возникающие благодаря работе фермента которая в качестве субстратов использует рибонуклеозндтрифосфаты.

И. Расплетание двойной спирали ДНК в зоне репликативной вилки катализнруется , использующей для направленного движения по ДНК энергию гидролиза АТР. К. Способствующие расплетанню ДНК связываются с одноцепочечной ДНК таким образом, что основания становятся доступными для реакции матричного синтеза. Л. Если ДНК-полимераза ошибается при образовании пары оснований, соединенных друг с другом водородными связями, то ошибка исправляется специальной системой (репарации повреждений), которая отличает новые цепи от старых по признаку метилирования.

М. Для бактерий и некоторых вирусов, инфицирующих эукариотические клетки, было показано, что реплнкационные глазки образуются в тех участках молекулы ДНК, где находятся специальные последовательности, называемые Н. можно рассматривать как «обратимые нуклеазы», которые создают либо кратковременный одноцепочечный разрыв (тип 1), либо кратковременный двухцепочечный разрыв (тнп 11). 5-21 Укажите, какие из следующих утверждений правильные, а какиенет. Если утверждение неверно, объясните почему. А. У Е. сей репликативная вилка продвигается вперед со скоростью Основные генетические механизмы 23 500 п.

н. в секунду, а цепи ДНК перед вилкой вращаются с круговой скоростью почти 3000 об(мин. Полуконсервативная репликация означает, что родительские цепи ДНК служат матрицами для синтеза новых, дочерних, цепей ДНК, так что новые двухцепочечные молекулы ДНК оказываются составленными из одной старой и одной новой цепи. При считывании в том же направлении (от 5′- к 3′-концу) последовательность нуклеотидов новосинтезированной цепи ДНК получается такой же, как в родительской матричной цепи, Синтез ДНК в направлении от 5′- к 3′-концу означает, что удлинение цепи происходит за счет присоединения дезоксинуклеозидтрифосфатов к свободной 3′-ОН-группе (с отщеплением пирофосфата). Сигггез ДНК происходит в направлении от 5′- к 3′-концу на ведущей цепи и в направлении от 3′- к 5′-концу иа отстающей цепи.

Если бы полимеризация ДНК происходила в направлении от 3′- 5′, то растущий конец цепи заканчивался бы 5′-трифосфатом или в качестве предшественников должны были бы использоваться 3′-дезоксннуклеозидтрифосфаты. При утрате ДНК-полимеразой Гь сой (3′- 5′)-экзонуклеазной активности должна уменьшиться скорость синтеза ДНК, но не его точность. Белки, связывающиеся с одноцепочечной ДНК в репликативной вилке, держат две цепи ДНК разделенными, закрывая собой основания и предотвращая тем самым их спаривание друг с другом.

У Ь’. сой репаративная система, исправляющая неправильное спаривание оснований и зависящая от их метилирования, может различать родительскую и дочернюю цепи ДНК, когда одна или обе цепи метнлированы, но не может этого делать, если обе цепи не метилированы. У Е со!~’ и у вирусов, инфицирующих эукариотические клетки, новые циклы репликацин ДНК начинаются со специфического участка, часто содержащего несколько копий короткой последовательности, с которой связывается комплекс белков, участвующих в инициации процесса.

Для разрыва и сшивки заново цепей ДНК ферментом топоизомеразой 1 не нужен АТР, потому что энергия фосфодиэфирной связи временно накапливается в ковалентной связи фосфотирозина в активном центре фермента. В клетках дрожжей, мутантных по топоизомеразе 11, ДНК может реплицироваться, но хромосомы не могут разделяться в процессе митоза. à — Д И К Рве. 5-15. Фрагмент ДНК с одно- цепочечиым участком, образовав- шимся вследствие разрыва в ниж- ней цепи (задача 5-22).

5-22 Фрагмент ДНК, изображенный на рис. 5-15, является двухцепочечным на концах и одноцепочечным в середине. Для верхней цепи указана полярность. А. На каком конце фрагмента, 5′ или 3′, находится указанный на нижней цепи остаток фосфата (Р)? Б. Каким способом, по вашему мнению, будет заполняться с помощью репаративных внутриклеточных процессов разрыв в цепи ДНК? В.

Сколько фрагментов будет содержаться в нижней цепи (рис. 5-15), если разрыв в ней заполняется (в условиях реакции в пробирке) при наличии в среде только дезоксирибонуклеозидтрифосфатов и ДНК-полимеразы? 24 Глава б 5-23 Важный подход к изучению репликации ДНК вЂ” это применение электронной микроскопии, благодаря которой можно непосредственно наблюдать репликативную вилку, а на мелких молекулах ДНК можно видеть всю реплицирующуюся структуру.

Кроме того, при использовании специальных методов приготовления образцов можно отличать двухцепочечную ДНК от одноцепочечной. На рис. 5-16 изображен ряд пшотетических реплицируюгцихся молекул с участками одноцепочечной ДНК, показанными тонкими линиями. В одном раннем и очень важном электронно-микроскопическом исследовании реплнкации у бактериофага лямбда некоторые из этих структур были действительно обнаружены н встречались часто, а другие никогда не наблюдались. А.

Нарисуйте схематически репликационную структуру с двумя вилкамн, смещающимися в противоположных направлениях. Пометьте концы всех цепей (5′ или 3′) и укажите лидирующую и отстающую цепи в каждой репликативной вилке. Б. На основе своих знаний по рспликации ДНК укажите четыре структуры на рис. 5-16, которые наблюдались наиболее часто. Рис. 5-16. Гипотетические структу- ры реплицирующихся молекул (задача 5-23). Рис.

5-17. Искусственный субстрат для изучения процесса коррекции„ осуществляемого ДНК-полимера- зой 1 у Е. сой (залвча 5-24). Выделеннымн буквами обозначены нуклеотиды с радиоактивной мет- кой. Остатки, содержащие з’ радиоактивную метку ~ос — — и’ 5 ‘…. ТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТ~ з …. А В отсутсгеие дезокситимидинтрнфосямте 1дттр! Б В яристтстеии Еттр ее 100 ВО .б н в о40 Ряс. 5-18. Коррекция ДНК-полимеразой 1 в отсутствие (А) н в при- 0 сутствии (Б) ЙТТР (залача 5-24).

Рвс тел ств ДН (спр тра был пере 1 2 3 4 Время, мни Время, мин 5-24 ДНК-полимераза 1 обладает кроме своей полимеразной активности еще и (3′- 5′)-экзонуклеазной активностью. Эта активность проявляется во время коррекции для удаления неправильно спаренных оснований с конца новосинтезированной цепи ДНК. Чтобы определить эту активность, необходимо приготовить искусственный субстрат с одной ро1у(с1А)-цепью и одной ро1у(дТ)-цепью, который содержит на 3′-конце несколько остатков дТ, меченных «Р, за которыми следует несколько остатков г(С, меченных зН, как показано на рис.

5-17. Вы измеряете потерю меченых остатков с)Т и дС в отсутствие г(ТТР, когда синтез ДНК невозможен, и в присутствии г(ТТР, когда синтез ДНК может происходить. Соответствующие результаты представлены на рис. 5-!8. А. Для чего остатки Т и С пометили разными изотопами? Основные генетические механизмы 25 дит, а С-остатки отщепляются независимо от того, есть ли в реак- ционной смеси г)ТТР? Г. Можно ли ожидать изменения результатов, представленных на рис. 5-18, Б, если добавить дСТР и дТТР? Где образуется РНК-затравка, на специфических или на случайных участках матрицы? Идеальной матрицей при изучении этого вопроса может служить ДНК вируса М13, потому что она не содержит 3′-ОН-группы.

Для ответа на данный вопрос кольцевую ДНК этого вируса полностью копировали в присутствии ДНК-полимеразы бактериофага Т4, праймосомы Т4 (хомплекс геликазы и РНК-праймазы), различных ТАТР (рибонуклеозидтрифосфатов) и гПь)ТР (дезоксирибонуклеозидтрифосфатов). Затем двухцепочечные кольцевые продукты обрабатывали рестриктазой, которая расщепляет двойную цепь в специфическом участке. Продукты этого расщепления подвергали денатурации, после чего анализировали последовательность нуклеотидов ДНК методом гель-электрофореза с высоким разрешением. Было обнаружено много отдельных полос. Если продукты расщепления до электрофореза обрабатывали РНКазой, то все они становились на пять нуклеотидов короче, о чем свидетельствовала более быстрая миграция их в секвенирующем геле. Зная, что каждый продукт рестрикции заканчивается специфическим участком рестрикции, можно было по длине продукта установить матричную последовательность вблизи 5′-конца.

(Полная последовательность М13 известна.) Некоторые из этих матричных последовательностей показаны на рис. 5-19 слева. Последовательность ДНК на каждом нз соответствующих 5′-концов цепей продуктов была определена после удаления РНК-затравки. Эти последовательности показаны на рис. 5-19, справа, в той же строчке, что и комплементарная последовательность матричной ДНК.

Определите на основе этих данных стартовый участок для РНК-затравки на каждой матричной последовательности. Какой сигнал нужен для начала реакции, катализируемой РНК-праймазой? Ген ЫпаВ у Е. сей кодирует геликазу, которая участвует в расплетании ДНК на участке репликативной вилки. Свойства этого фермента были изучены с использованием искусственных суб- 5-26 Последовательности ДНК, связанные е РНК-затравкой 5′ 3′ Ааахт савах Асхат свтат тсххт Ававт тхттт тстха Сейт Мвтрнчные поепеловвгеяьноетн М!3 5′ Атс тот 3′ сттасаттахххт татттастссхах стсттатттастс тастхаттттхса авсхтастхаттт ттсстатттттаа тАтттасттАтАс аААсааттАссст Рис.

5-19. Матричные последовательности М13 (слева) и соответствующие последовательности ДНК, образуемые в каждом сайте (епрввв) во время синтеза РНК-затравки (задача 5-25). РНК-затравки были отделены от этих цепей ДНК перед секвепироваиием. Атт АСА Атт Атс ААА стх Б. Почему отщепление Т-остатков в отсутствие г(ТТР требует больше времени, чем отщеплеиие С-остатков? В. Почему в присутствии дТТР отщепления Т-остатков не происхо- 26 Глава б Область отаранных оснований 3 стратов, подобных тем, которые изображены на рис.

From Wikipedia, the free encyclopedia

The polymerase chain reaction (PCR) is a commonly used molecular biology tool for amplifying DNA, and various techniques for PCR optimization which have been developed by molecular biologists to improve PCR performance and minimize failure.

Contamination and PCR[edit]

The PCR method is extremely sensitive, requiring only a few DNA molecules in a single reaction for amplification across several orders of magnitude. Therefore, adequate measures to avoid contamination from any DNA present in the lab environment (bacteria, viruses, or human sources) are required. Because products from previous PCR amplifications are a common source of contamination, many molecular biology labs have implemented procedures that involve dividing the lab into separate areas.^[1] One lab area is dedicated to preparation and handling of pre-PCR reagents and the setup of the PCR reaction, and another area to post-PCR processing, such as gel electrophoresis or PCR product purification. For the setup of PCR reactions, many standard operating procedures involve using pipettes with filter tips and wearing fresh laboratory gloves, and in some cases a laminar flow cabinet with UV lamp as a work station (to destroy any extraneomultimer formation). PCR is routinely assessed against a negative control reaction that is set up identically to the experimental PCR, but without template DNA, and performed alongside the experimental PCR.

Hairpins[edit]

Secondary structures in the DNA can result in folding or knotting of DNA template or primers, leading to decreased product yield or failure of the reaction. Hairpins, which consist of internal folds caused by base-pairing between nucleotides in inverted repeats within single-stranded DNA, are common secondary structures and may result in failed PCRs.

Typically, primer design that includes a check for potential secondary structures in the primers, or addition of DMSO or glycerol to the PCR to minimize secondary structures in the DNA template,^[2] are used in the optimization of PCRs that have a history of failure due to suspected DNA hairpins.

Polymerase errors[edit]

Taq polymerase lacks a 3′ to 5′ exonuclease activity. Thus, Taq has no error-proof-reading activity, which consists of excision of any newly misincorporated nucleotide base from the nascent (i.e., extending) DNA strand that does not match with its opposite base in the complementary DNA strand. The lack in 3′ to 5′ proofreading of the Taq enzyme results in a high error rate (mutations per nucleotide per cycle) of approximately 1 in 10,000 bases, which affects the fidelity of the PCR, especially if errors occur early in the PCR with low amounts of starting material, causing accumulation of a large proportion of amplified DNA with incorrect sequence in the final product.^[3]

Several «high-fidelity» DNA polymerases, having engineered 3′ to 5′ exonuclease activity, have become available that permit more accurate amplification for use in PCRs for sequencing or cloning of products. Examples of polymerases with 3′ to 5′ exonuclease activity include: KOD DNA polymerase, a recombinant form of Thermococcus kodakaraensis KOD1; Vent, which is extracted from Thermococcus litoralis; Pfu DNA polymerase, which is extracted from Pyrococcus furiosus; Pwo, which is extracted from Pyrococcus woesii;^[4] Q5 polymerase, with 280x higher fidelity amplification compared with Taq.^[5]

Magnesium concentration[edit]

Magnesium is required as a co-factor for thermostable DNA polymerase. Taq polymerase is a magnesium-dependent enzyme and determining the optimum concentration to use is critical to the success of the PCR reaction.^[6] Some of the components of the reaction mixture such as template concentration, dNTPs and the presence of chelating agents (EDTA) or proteins can reduce the amount of free magnesium present thus reducing the activity of the enzyme.^[7] Primers which bind to incorrect template sites are stabilized in the presence of excessive magnesium concentrations and so results in decreased specificity of the reaction. Excessive magnesium concentrations also stabilize double stranded DNA and prevent complete denaturation of the DNA during PCR reducing the product yield.^[6][7] Inadequate thawing of MgCl₂ may result in the formation of concentration gradients within the magnesium chloride solution supplied with the DNA polymerase and also contributes to many failed experiments .^[7]

Size and other limitations[edit]

PCR works readily with a DNA template of up to two to three thousand base pairs in length. However, above this size, product yields often decrease, as with increasing length stochastic effects such as premature termination by the polymerase begin to affect the efficiency of the PCR. It is possible to amplify larger pieces of up to 50,000 base pairs with a slower heating cycle and special polymerases. These are polymerases fused to a processivity-enhancing DNA-binding protein, enhancing adherence of the polymerase to the DNA.^[8][9]

Other valuable properties of the chimeric polymerases TopoTaq and PfuC2 include enhanced thermostability, specificity and resistance to contaminants and inhibitors.^[10][11] They were engineered using the unique helix-hairpin-helix (HhH) DNA binding domains of topoisomerase V^[12] from hyperthermophile Methanopyrus kandleri. Chimeric polymerases overcome many limitations of native enzymes and are used in direct PCR amplification from cell cultures and even food samples, thus by-passing laborious DNA isolation steps. A robust strand-displacement activity of the hybrid TopoTaq polymerase helps solve PCR problems that can be caused by hairpins and G-loaded double helices. Helices with a high G-C content possess a higher melting temperature, often impairing PCR, depending on the conditions.^[13]

Non-specific priming[edit]

Non-specific binding of primers frequently occurs and may occur for several reasons. These include repeat sequences in the DNA template, non-specific binding between primer and template, high or low G-C content in the template, or incomplete primer binding, leaving the 5′ end of the primer unattached to the template. Non-specific binding of degenerate primers is also common. Manipulation of annealing temperature and magnesium ion concentration may be used to increase specificity. For example, lower concentrations of magnesium or other cations may prevent non-specific primer interactions, thus enabling successful PCR. A «hot-start» polymerase enzyme whose activity is blocked unless it is heated to high temperature (e.g., 90–98˚C) during the denaturation step of the first cycle, is commonly used to prevent non-specific priming during reaction preparation at lower temperatures. Chemically mediated hot-start PCRs require higher temperatures and longer incubation times for polymerase activation, compared with antibody or aptamer-based hot-start PCRs.^{[citation needed]}

Other methods to increase specificity include Nested PCR and Touchdown PCR.

Computer simulations of theoretical PCR results (Electronic PCR) may be performed to assist in primer design.^[14]

Touchdown polymerase chain reaction or touchdown style polymerase chain reaction is a method of polymerase chain reaction by which primers will avoid amplifying nonspecific sequences. The annealing temperature during a polymerase chain reaction determines the specificity of primer annealing. The melting point of the primer sets the upper limit on annealing temperature. At temperatures just below this point, only very specific base pairing between the primer and the template will occur. At lower temperatures, the primers bind less specifically. Nonspecific primer binding obscures polymerase chain reaction results, as the nonspecific sequences to which primers anneal in early steps of amplification will «swamp out» any specific sequences because of the exponential nature of polymerase amplification.

The earliest steps of a touchdown polymerase chain reaction cycle have high annealing temperatures. The annealing temperature is decreased in increments for every subsequent set of cycles (the number of individual cycles and increments of temperature decrease is chosen by the experimenter). The primer will anneal at the highest temperature which is least-permissive of nonspecific binding that it is able to tolerate. Thus, the first sequence amplified is the one between the regions of greatest primer specificity; it is most likely that this is the sequence of interest. These fragments will be further amplified during subsequent rounds at lower temperatures, and will out compete the nonspecific sequences to which the primers may bind at those lower temperatures. If the primer initially (during the higher-temperature phases) binds to the sequence of interest, subsequent rounds of polymerase chain reaction can be performed upon the product to further amplify those fragments.

Primer dimers[edit]

Annealing of the 3′ end of one primer to itself or the second primer may cause primer extension, resulting in the formation of so-called primer dimers, visible as low-molecular-weight bands on PCR gels.^[15] Primer dimer formation often competes with formation of the DNA fragment of interest, and may be avoided using primers that are designed such that they lack complementarity—especially at the 3′ ends—to itself or the other primer used in the reaction. If primer design is constrained by other factors and if primer-dimers do occur, methods to limit their formation may include optimisation of the MgCl₂ concentration or increasing the annealing temperature in the PCR.^[15]

Deoxynucleotides[edit]

Deoxynucleotides (dNTPs) may bind Mg²⁺ ions and thus affect the concentration of free magnesium ions in the reaction. In addition, excessive amounts of dNTPs can increase the error rate of DNA polymerase and even inhibit the reaction.^[6][7] An imbalance in the proportion of the four dNTPs can result in misincorporation into the newly formed DNA strand and contribute to a decrease in the fidelity of DNA polymerase.^[16]

References[edit]

From Wikipedia, the free encyclopedia

The polymerase chain reaction (PCR) is a commonly used molecular biology tool for amplifying DNA, and various techniques for PCR optimization which have been developed by molecular biologists to improve PCR performance and minimize failure.

Contamination and PCR[edit]

The PCR method is extremely sensitive, requiring only a few DNA molecules in a single reaction for amplification across several orders of magnitude. Therefore, adequate measures to avoid contamination from any DNA present in the lab environment (bacteria, viruses, or human sources) are required. Because products from previous PCR amplifications are a common source of contamination, many molecular biology labs have implemented procedures that involve dividing the lab into separate areas.^[1] One lab area is dedicated to preparation and handling of pre-PCR reagents and the setup of the PCR reaction, and another area to post-PCR processing, such as gel electrophoresis or PCR product purification. For the setup of PCR reactions, many standard operating procedures involve using pipettes with filter tips and wearing fresh laboratory gloves, and in some cases a laminar flow cabinet with UV lamp as a work station (to destroy any extraneomultimer formation). PCR is routinely assessed against a negative control reaction that is set up identically to the experimental PCR, but without template DNA, and performed alongside the experimental PCR.

Hairpins[edit]

Secondary structures in the DNA can result in folding or knotting of DNA template or primers, leading to decreased product yield or failure of the reaction. Hairpins, which consist of internal folds caused by base-pairing between nucleotides in inverted repeats within single-stranded DNA, are common secondary structures and may result in failed PCRs.

Typically, primer design that includes a check for potential secondary structures in the primers, or addition of DMSO or glycerol to the PCR to minimize secondary structures in the DNA template,^[2] are used in the optimization of PCRs that have a history of failure due to suspected DNA hairpins.

Polymerase errors[edit]

Taq polymerase lacks a 3′ to 5′ exonuclease activity. Thus, Taq has no error-proof-reading activity, which consists of excision of any newly misincorporated nucleotide base from the nascent (i.e., extending) DNA strand that does not match with its opposite base in the complementary DNA strand. The lack in 3′ to 5′ proofreading of the Taq enzyme results in a high error rate (mutations per nucleotide per cycle) of approximately 1 in 10,000 bases, which affects the fidelity of the PCR, especially if errors occur early in the PCR with low amounts of starting material, causing accumulation of a large proportion of amplified DNA with incorrect sequence in the final product.^[3]

Several «high-fidelity» DNA polymerases, having engineered 3′ to 5′ exonuclease activity, have become available that permit more accurate amplification for use in PCRs for sequencing or cloning of products. Examples of polymerases with 3′ to 5′ exonuclease activity include: KOD DNA polymerase, a recombinant form of Thermococcus kodakaraensis KOD1; Vent, which is extracted from Thermococcus litoralis; Pfu DNA polymerase, which is extracted from Pyrococcus furiosus; Pwo, which is extracted from Pyrococcus woesii;^[4] Q5 polymerase, with 280x higher fidelity amplification compared with Taq.^[5]

Magnesium concentration[edit]

Magnesium is required as a co-factor for thermostable DNA polymerase. Taq polymerase is a magnesium-dependent enzyme and determining the optimum concentration to use is critical to the success of the PCR reaction.^[6] Some of the components of the reaction mixture such as template concentration, dNTPs and the presence of chelating agents (EDTA) or proteins can reduce the amount of free magnesium present thus reducing the activity of the enzyme.^[7] Primers which bind to incorrect template sites are stabilized in the presence of excessive magnesium concentrations and so results in decreased specificity of the reaction. Excessive magnesium concentrations also stabilize double stranded DNA and prevent complete denaturation of the DNA during PCR reducing the product yield.^[6][7] Inadequate thawing of MgCl₂ may result in the formation of concentration gradients within the magnesium chloride solution supplied with the DNA polymerase and also contributes to many failed experiments .^[7]

Size and other limitations[edit]

PCR works readily with a DNA template of up to two to three thousand base pairs in length. However, above this size, product yields often decrease, as with increasing length stochastic effects such as premature termination by the polymerase begin to affect the efficiency of the PCR. It is possible to amplify larger pieces of up to 50,000 base pairs with a slower heating cycle and special polymerases. These are polymerases fused to a processivity-enhancing DNA-binding protein, enhancing adherence of the polymerase to the DNA.^[8][9]

Other valuable properties of the chimeric polymerases TopoTaq and PfuC2 include enhanced thermostability, specificity and resistance to contaminants and inhibitors.^[10][11] They were engineered using the unique helix-hairpin-helix (HhH) DNA binding domains of topoisomerase V^[12] from hyperthermophile Methanopyrus kandleri. Chimeric polymerases overcome many limitations of native enzymes and are used in direct PCR amplification from cell cultures and even food samples, thus by-passing laborious DNA isolation steps. A robust strand-displacement activity of the hybrid TopoTaq polymerase helps solve PCR problems that can be caused by hairpins and G-loaded double helices. Helices with a high G-C content possess a higher melting temperature, often impairing PCR, depending on the conditions.^[13]

Non-specific priming[edit]

Non-specific binding of primers frequently occurs and may occur for several reasons. These include repeat sequences in the DNA template, non-specific binding between primer and template, high or low G-C content in the template, or incomplete primer binding, leaving the 5′ end of the primer unattached to the template. Non-specific binding of degenerate primers is also common. Manipulation of annealing temperature and magnesium ion concentration may be used to increase specificity. For example, lower concentrations of magnesium or other cations may prevent non-specific primer interactions, thus enabling successful PCR. A «hot-start» polymerase enzyme whose activity is blocked unless it is heated to high temperature (e.g., 90–98˚C) during the denaturation step of the first cycle, is commonly used to prevent non-specific priming during reaction preparation at lower temperatures. Chemically mediated hot-start PCRs require higher temperatures and longer incubation times for polymerase activation, compared with antibody or aptamer-based hot-start PCRs.^{[citation needed]}

Other methods to increase specificity include Nested PCR and Touchdown PCR.

Computer simulations of theoretical PCR results (Electronic PCR) may be performed to assist in primer design.^[14]

Touchdown polymerase chain reaction or touchdown style polymerase chain reaction is a method of polymerase chain reaction by which primers will avoid amplifying nonspecific sequences. The annealing temperature during a polymerase chain reaction determines the specificity of primer annealing. The melting point of the primer sets the upper limit on annealing temperature. At temperatures just below this point, only very specific base pairing between the primer and the template will occur. At lower temperatures, the primers bind less specifically. Nonspecific primer binding obscures polymerase chain reaction results, as the nonspecific sequences to which primers anneal in early steps of amplification will «swamp out» any specific sequences because of the exponential nature of polymerase amplification.

The earliest steps of a touchdown polymerase chain reaction cycle have high annealing temperatures. The annealing temperature is decreased in increments for every subsequent set of cycles (the number of individual cycles and increments of temperature decrease is chosen by the experimenter). The primer will anneal at the highest temperature which is least-permissive of nonspecific binding that it is able to tolerate. Thus, the first sequence amplified is the one between the regions of greatest primer specificity; it is most likely that this is the sequence of interest. These fragments will be further amplified during subsequent rounds at lower temperatures, and will out compete the nonspecific sequences to which the primers may bind at those lower temperatures. If the primer initially (during the higher-temperature phases) binds to the sequence of interest, subsequent rounds of polymerase chain reaction can be performed upon the product to further amplify those fragments.

Primer dimers[edit]

Annealing of the 3′ end of one primer to itself or the second primer may cause primer extension, resulting in the formation of so-called primer dimers, visible as low-molecular-weight bands on PCR gels.^[15] Primer dimer formation often competes with formation of the DNA fragment of interest, and may be avoided using primers that are designed such that they lack complementarity—especially at the 3′ ends—to itself or the other primer used in the reaction. If primer design is constrained by other factors and if primer-dimers do occur, methods to limit their formation may include optimisation of the MgCl₂ concentration or increasing the annealing temperature in the PCR.^[15]

Deoxynucleotides[edit]

Deoxynucleotides (dNTPs) may bind Mg²⁺ ions and thus affect the concentration of free magnesium ions in the reaction. In addition, excessive amounts of dNTPs can increase the error rate of DNA polymerase and even inhibit the reaction.^[6][7] An imbalance in the proportion of the four dNTPs can result in misincorporation into the newly formed DNA strand and contribute to a decrease in the fidelity of DNA polymerase.^[16]

References[edit]